扣囊复膜酵母在红枣酒中的应用

雷炎，刘梦琦，易秦振，单春会，侯强川，郭壮*

（1.湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053；2.石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）又称扣囊复膜孢酵母，隶属于子囊菌门（Ascomycota）中的酵母科（Saccharomycopsidaceae），通过多极出芽和形成菌丝体进行增殖，是一类产子囊孢子的二形态酵母[1]。由于具有高产淀粉酶[2]、酸性蛋白酶[3]和β-葡萄糖苷酶[4]的特性，S.fibuligera 可利用蔗糖、纤维二糖和可溶性淀粉等碳水化合物产酒精，加之具有一定的产酯能力[5]，因而被认为在酿酒工业中具有较大的应用潜力。研究表明，米酒曲[6-7]、绍兴黄酒酒药[8]及浓香型、酱香型和清香型白酒酒曲中[9]蕴含了丰富的S.fibuligera 菌株资源，因而从酒曲中进行S.fibuligera 菌株的分离具有较大的可行性[10]。不同地域来源的同种微生物菌株，其遗传多样性和发酵特性均存在较大差异[11]。作为中国地理标识产品，东柳醪糟以糯米为原料使用米酒曲发酵而成，酿造历史悠久且颇具地方特色，因而从其酒曲中进行S.fibuligera 的分离具有较强的可操作性。

作为发酵果酒，红枣酒是以红枣为原料，通过酵母菌的代谢将自身含有的糖转化为酒精，因具有浓郁的红枣果香和清爽的口感而深受消费者喜爱[12]。和东芹研究发现使用S. fibuligera E9802 酿造的红枣酒枣香突出、酒体丰满且风味良好[13]，因而将S.fibuligera 用于红枣酒的酿造具有一定可行性。色度仪[14]、电子舌[15]和电子鼻[16]等测试技术的出现，实现了食品色泽、滋味和风味品质的数字化评价，具有对研究人员专业知识要求低和结果受主观因素影响小的优点，广泛用于食品的品质评价中。

采用纯培养技术，本研究拟从四川省达州市大竹县的东柳米酒曲中进行S.fibuligera 菌株的分离，并从理化指标、色泽、风味和滋味等维度对分离株酿造红枣酒的品质进行评价，在进一步论证S.fibuligera 用于红枣酒酿造可行性的同时，亦为后续相关研究的开展提供菌株支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

引物M13F（-47）/M13R（-48）、NS1/NL4：武汉天一辉远生物科技有限公司；Axygen PCR 清洁试剂盒：康宁生命科学吴江有限公司；DL15000 Marker、DL2000 Marker、PCR buffer、rTaq DNA 聚合酶、pMD18-T 克隆载体：宝生物工程（大连）有限公司；骏枣（Jun jujube）：新疆维吾尔自治区石河子市；白砂糖：市售；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、酵母粉麦芽糖（YM）培养基：青岛海博生物技术有限公司；偏重亚硫酸钾：意大利ESSECO公司；果胶酶（50 000U/g）：和氏璧生物科技有限公司；酒石酸（食品级）：湖北糖柜食品有限公司；电子舌配套溶液：日本INSENT 公司。

HR40-ⅡB2 型生物安全柜：青岛海尔股份有限公司；CR21N 高速离心机：日本日立公司；PTC-100PCR仪：美国Bio-Rad 公司；LHR-150 生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；9231 破壁榨汁机：奥克斯集团有限公司；SHZ-D 循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司；RE52CS 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；FCH6-20 智能高低循环水器：山东海能科学仪器有限公司；Abbemat350 全自动折光仪：奥地利安东帕公司；UltraScan PRO 色度仪：美国HunterLab 公司；PEN3 电子鼻：德国Airsense 公司；SA-402B 电子舌：日本INSENT 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酒曲样品的采集及酵母菌的分离鉴定

从四川省达州市大竹县东柳乡采集10 个米酒曲样品，使用研钵将其碾碎后进行倍比稀释并涂布于PDA 固体培养基上，28 ℃培养48 h 挑选具有酵母菌菌落特征的菌株分离纯化后备用[17]。参照赵慧君的方法，使用消解酶-氯化苄法进行DNA 提取和26S rDNA 扩增[18]，经清洁、连接和转化后的扩增子委托武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序，反馈回的序列在Gen－Bank 数据库进行Blast 同源性比对，进而明确其分类学地位。切除引物的序列，提交至NCBI 网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）公开并获得GenBank 登录号。

1.2.2 红枣酒的制备

去核骏枣以1∶5 的质量比加入去离子水中，同时加入总重0.006%的偏重亚硫酸钾，置于破壁榨汁机打浆30 s。浆液中加入总重0.3%的果胶酶45 ℃酶解1 h后依次使用蔗糖调节可溶性固形物至22%，并滴加酒石酸调pH 值至3.9[19]。红枣浆分装于1 L 玻璃发酵罐中，按照5×107CFU/mL 浆液的比例接入1.2.1 中分离的S.fibuligera，22 ℃恒温发酵。为对各菌株的发酵特性进行对比，若有1 个样品的糖浓度72 h 内保持不变，则停止所有样品的发酵，浆液4 层纱布过滤后，4 ℃8 000 r/min 离心10 min，滤液用于后续各指标检测。

1.2.3 红枣酒理化性质的测定

参考国家标准GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法对红枣酒酒精含量进行测定。使用全自动折光仪对红枣酒的可溶性固形物含量进行测定。

1.2.4 红枣酒色度的测定

参照葛东颖的方法[20]，将样品置于50 mm×10 mm×50 mm 石英比色皿中，选择透射模式进行测定，每个样品重复3 次。

1.2.5 红枣酒风味品质的评价

参照周书楠的方法[21]，取15 mL 红枣酒于顶空瓶中，55 ℃水浴10 min 后室温（25 ℃左右）平衡10 min，使用PEN3 电子鼻进行测试。PEN3 电子鼻配有10 套传感器，但由于传感器W5S、W6S、W1S 和W1W 主要用于环境样品中氮氧化物、氢气、甲烷和萜类物质的检测，上述化合物在红枣酒中不存在，故而本研究仅使用其他6 组传感器。

1.2.6 红枣酒滋味品质的评价

参照潘婷的方法[22]，取100 mL 红枣酒均分于2 个样品杯中，使用SA402B 电子舌对其酸味、苦味、涩味、咸味和鲜味等5 个基本味和后味A（涩味的回味）、后味B（苦味的回味）和丰度（鲜味的回味）等3 个回味进行测定。

1.2.7 数据分析

基于邻接法（neighbor-joining，JN）使用MEGA5.0软件构建系统发育树；基于主成分分析（principal component analysis，PCA）使用SAS8.0 软件对红枣酒品质进行整体评价；使用Origin 2017 绘制其他图。

2 结果与分析

2.1 酒曲中酵母菌26S rDNA 同源性分析

本研究从10 个米酒曲样品中分离出24 株疑似酵母菌的菌株，在对其26S rDNA 序列进行拼接和同源性比对的基础上构建系统发育树，结果如图1 所示，其中树枝节点值是检验置信值，树枝长度代表菌株差异程度。

图1 基于26S rDNA 基因的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on 26S rDNA gene

如图1 所示，HBUAS61134 等16 株菌被鉴定为S. fibuligera （扣囊复膜酵母），HBUAS61142 和HBUAS61144 被鉴定为Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母），HBUAS61131 和HBUAS61133 被鉴定为Wickerhamomyces anomalus （异常威克汉姆酵母），HBUAS61147 被鉴定为Candida glabrata（光滑念球菌），HBUAS61159 被鉴定为C. tropicalis（热带念球菌），HBUAS61143 被鉴定为Pichia kudriavzevii（毕赤酵母），HBUAS61139 被鉴定为Cyberlindnera fabianii（费比恩塞伯林德纳氏酵母）。酵母菌种属的构成比例如图2 所示。

图2 不同酵母菌类群相对含量的饼图Fig.2 Pie chart of the relative contents of different yeast groups

由图2 可知，鉴定为S.fibuligera 的菌株占总分离株的66.67%，S.cerevisiae 和W.anomalus 均占总分离菌株的8.33%，C. glabrata、C. tropicalis、P. kudriavzevii和C.fabianii 均占总分离菌株的4.17%。由此可见，S.fibuligera 为东柳米酒曲中的优势酵母菌。

2.2 红枣酒理化指标和色泽的评价

本研究使用16 株S.fibuligera 分别进行了红枣酒的制备。酿造好的红枣酒颜色呈枣红色，具有较高的透明度和澄清度，酒香味浓郁，红枣特有风味突出，入口后部分样品酒体协调且纯正无杂，但部分样品口感偏酸且苦味较重。因感官鉴评方法对评价人员专业知识和经验要求均较高，为保证结果的可靠性，本研究使用色度仪、电子鼻和电子舌等设备对红枣酒各指标进行了数字化评价，其酒精度、可溶性固形物含量和色度指标如表1 所示。

表1 红枣酒理化和色度指标分析（n=16）Table 1 Analysis of physic-chemical and chroma indexes of jujube wine（n=16）

由表1 可知，16 个红枣酒样品的酒精度在8.1%vol ～11.9%vol，可溶性固形物含量在7.59%～17.21%，明度值在65.31～78.73，红绿值在7.53～14.77，黄蓝值在66.64～76.33，颜色整体偏红偏黄。由此可见，不同酵母菌分离株在红枣酒中对糖的利用和产酒精的能力不同。

2.3 基于电子鼻技术红枣酒风味品质的评价

基于电子鼻技术红枣酒挥发性物质的分析结果如表2 所示。

表2 基于电子鼻技术红枣酒挥发性物质的分析（n=16）Table 2 Analysis of volatile substances in jujube wine by electronic nose（n=16）

由表2 可知，乙醇为红枣酒挥发性化合物的主要成分，其次为有机硫化物和烷烃类化合物，传感器W2S、W2W 和W3S 在各红枣酒样品中和空气中响应值的比值范围分别在55.68～124.12、3.54～9.19 和2.78～5.77，而对芳香类物质敏感的各传感器响应值比值均较低。

2.4 基于电子舌技术红枣酒滋味品质的评价

红枣酒不同滋味指标的相对强度如图3 所示。

图3 基于电子舌技术红枣酒不同滋味指标相对强度的箱型图（n=16）Fig.3 Box chart of relative intensity of different taste indexes in jujube wine by electronic tongue（n=16）

由图3 可知，16 个红枣酒样品在酸味指标上差异最大，相对强度的极差值为4.48，在鲜味、咸味和丰度（鲜味的回味）指标上的差异较大，极差值分别为2.33、2.11 和1.30。SA402B 电子舌具有较高的灵敏度，若两个样品在某一传感器上的相对强度差值小于1.0，虽其存在差异，但通过感官鉴评的方法不能予以区分[24]。各样品在苦味、后味B（苦味的回味）、涩味和后味A（涩味的回味）指标上的极差值分别为0.93、0.72、0.60 和0.37，由于极差值均小于1.0，故而其差异不会对产品品质造成影响。由于红枣酒在制作过程中不使用热杀菌，仅通过添加偏重亚硫酸钾抑制微生物生长，因而红枣和制作器具自身携带的微生物及环境中的微生物不能被完全杀死，外源接入酵母菌仅使其成为了红枣酒发酵过程中的绝对优势菌株，因而红枣酒的发酵是多菌株参与的过程[25]，这可能是导致本研究中红枣酒在酸味和鲜味等指标上存在差异的原因。

2.5 基于主成分分析红枣酒整体品质的评价

本研究采用PCA 对16 个红枣酒样品品质进行了整体评价，结果发现19 个指标可划分为5 个主成分（principal component，PC），其贡献率分别为48.36%、15.44%、8.13%、7.61%和5.73%，其中PC1 由涩味、咸味、W1C、W3C、W2S 和W3S 6 个指标构成，PC2 由酸味、鲜味、L*、a*和b*5 个指标构成，PC3 由苦味和丰度（鲜味的回味）构成，PC4 由后味B（苦味的回味）、W5C、酒精度和可溶性固形物含量4 个指标构成，PC5由后味A（涩味的回味）和W2W 构成。因PC1 贡献率最高，而PC4 中包含了酒精度和可溶性固形物含量等重要指标，故而选择PC1 和PC4 进行因子载荷图构建，如图4 所示。

图4 PC1 与PC4 的因子载荷图Fig.4 Factor loading map of PC1 and PC4

由图4 可知，PC1 指标中W1C、W3C 和涩味分布在X=0 轴的左侧，而W2S、W3S 和咸味分布在X=0 轴的右侧；PC4 指标中后味B（苦味的回味）、酒精度和W5C 分布在Y=0 轴的上方，而可溶性固形物分布在Y=0 轴的下方。传感器W1C、W3C 和W5C 对红枣酒中的芳香类挥发性化合物灵敏，而酒精度的高低可直接反应S. fibuligera 在红枣酒中的发酵特性，因而上述4 个指标为红枣酒的特征性指标，故在因子得分图中分布于第二象限的样品具有较好的品质，基于PC1 和PC4 的因子得分图如图5 所示。

图5 PC1 与PC4 因子得分图Fig.5 Factor score map of PC1 and PC4

由图5 可知，仅有1 个样品分布于因子得分图第二象限，因而由S.fibuligera HBUAS61136 发酵的红枣酒具有良好的风味和较高的酒精度，在后续红枣酒相关产品开发中该菌株具有一定的应用潜力。为了进一步筛选出适用于红枣酒发酵的酵母菌，在后续研究中继续从不同地区米酒曲或其他酒曲中分离S.fibuligera 菌株，并探讨其单独发酵或与S.cerevisiae 等菌株复配发酵，对推动红枣酒发酵用发酵剂的研究具有积极意义。

3 结论

本研究从中国地理标识产品东柳醪糟米酒曲中进行了S.fibuligera 的分离，同时对分离株在红枣酒中的应用进行了评价，结果发现S.fibuligera 是该地米酒曲中的优势酵母菌，其分离株可用于红枣酒的酿造。乙醇为红枣酒挥发性风味物质的主要成分，且不同菌株酿造的红枣酒在酸味、酒精度和可溶性固形物上存在一定的差异，其中S.fibuligera HBUAS61136 酿造的红枣酒具有较好的风味品质和较高的酒精度，可用于后续相关研究中。