应用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）发酵薄荷抗氧化功能研究

刘贺，彭声静，张瑜瑜，尹利方，贾巧莉

（1.昆明学院农学与生命科学学院，云南昆明650214；2.云南省曲靖市质量技术监督综合检测中心，云南曲靖655000）

薄荷作为最受欢迎的药用植物之一，广泛用于家庭、调味品、医药和化妆品行业，其抗氧化性可预防白内障及其它与衰老有关的疾病，薄荷提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具有抑制作用[1]。此外，其风味在世界范围内均广为人知，是全世界第三大受欢迎风味。

近年来，由于消费趋势向健康食品发展，一些凉茶即草本植物混合饮料因其独特风味及潜在的功能特性受到欢迎。其加工方法为热水提取草本植物的叶子、种子、根或树皮等，其中薄荷茶是受欢迎的凉茶之一。然而目前草本茶在茶加工过程中其功能性物质常常遭到破坏，降低其本身营养价值[2]。近年来研究表明，发酵食品可有助于促进胃肠道健康，用合适的菌种发酵是解决各种果蔬生产过剩和促进加工利用的最佳途径[3]，且通过发酵，果蔬汁的抗氧化性均有所提升，Ryu 等[4]用植物乳杆菌CK10 发酵奇异果果汁发现发酵处理可提高奇异果果汁的DPPH 自由基及ABTS自由基清除能力；Hashemi 等[5]用植物乳杆菌LS5 发酵柠檬汁发现经发酵后，柠檬汁的抗氧化性增加；李敏杰等[6]也发现，用红茶菌发酵芒果果汁制酒，总酚含量、DPPH 自由基和羟自由基清除率均会上升，发酵第8 天达到峰值。然而目前有关发酵增强抗氧化性的研究大部分集中在果汁上，对草本植物发酵方面研究较少[2]。因此为促进薄荷加工，保留和提高其抗氧化等功能性，本研究开发了一种薄荷的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）发酵工艺。嗜酸乳杆菌可定殖于人体肠道而改善机体健康，且可产生全新风味[7]。研究发现，这种加工方法薄荷的抗氧化性得以保存及增强，因此，薄荷具有进一步开发成为一种新型功能性食品的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

留兰香薄荷：市售；甲醇、无水碳酸钠、三氯化铝、亚硝酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂：上海荔达生物科技有限公司；芦丁、没食子酸、DPPH 自由基、过氧化物酶（4.4 μ/mL）、2，2'-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azi nobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）-diammonium salt，ABTS]：美国Sigma 公司；过氧化氢：德国默克公司；嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus：科汉森（菌株型号FD-DVS LA-5）；琼脂：美国BD Difco 公司。

AL204 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHJ-A 恒温振荡仪：金坛市华峰仪器有限公司；SP-2100UV 紫外/可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.2 薄荷材料及菌株准备

将购于市场的薄荷株进行预处理，对其根、茎、叶进行分离和洗涤，将500 mL 去离子水分别加入到100 g根、茎、叶中，在室温25 ℃下用均质机进行均质，薄荷汁用于后续接种使用。

在嗜酸乳杆菌接种前，将其分别在MRS 琼脂平板和MRS 肉汤上继代培养两次。

1.3 活菌计数、可溶性固形物含量及pH 值测定

用平板计数琼脂（plate count agar，PCA）测定活菌数（viable bacterial count，VBC）、以手动折光仪测定可溶性固形物总量（total soluble solids，TSS），结果以°Brix表示，pH 值以手持pH 计进行测定。

1.4 薄荷发酵样品制备

将5 mL 乳酸菌发酵剂（5×106CFU/mL）接种到100 mL 薄荷根、茎、叶汁中，于37 ℃下发酵60 h。发酵结束后将发酵样品进行冻干，然后将冻干样品进行研磨后备用。

1.5 薄荷新鲜样品制备

分别取薄荷根、茎、叶5 g，以甲醇溶液300 mL 分次于80 ℃水浴中浸提30 min，提取液过滤后，将滤液旋转蒸发至5 mL 左右自然挥干溶剂，称量粗提物质量，并将其以去离子水定容至10 mL，待测。

1.6 总抗氧化活性测定

参照参考文献[8-9]。将过氧化物酶、50 μmol/L 过氧化氢、100 μmol/L ABTS 与1 mL 去离子水混合，于25 ℃置于黑暗环境中反应。接着添加1 mL 薄荷发酵液，并在734 nm 下测定吸光度。使用下式计算抗氧化能力。

1.7 还原力测定

参照参考文献[10]。将1 mL 薄荷发酵液、磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6，0.5 mL）和铁氰化钾溶液（1%，2.5 mL）混合并在50 ℃下加热20 min。冷却至25 ℃后，添加0.5mL 10%三氯乙酸。在5 000 r/min 下离心10 min后，取1 mL 上清液与1 mL 去离子水和0.1 mL 0.1%氯化铁混合后保持反应10 min。测定反应混合物700 nm下吸光度，吸光度高则表明还原能力较高。

1.8 DPPH 自由基清除能力测定

参照参考文献[11]。0.1 mL 薄荷发酵液加入到3.9 mL 的125 μmol/L DPPH·甲醇溶液中，振荡后于25 ℃避光稳定30 min，在517 nm 下以甲醇为参比测定吸光度。对照液为0.1 mL 甲醇加入到3.9 mL 的125 μmol/L DPPH·甲醇溶液中。样品的自由基清除率可根据下列公式进行计算。

1.9 超氧阴离子自由基清除能力测定

参照参考文献[12]。将120 μmol/L 的吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、936 μmol/L 的α-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（α-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase，α-NADH）和300 μmol/L的硝基蓝四氮唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）溶液与50 μL 的薄荷发酵液混合反应5 min，记录560 nm下吸光度。自由基清除能力按下式计算。

1.10 总酚及总黄酮含量测定

总酚含量测定参照参考文献[11，13]。取待测液0.2 mL 加去离子水至总体积5 mL，加入5 mL 福林酚试剂（使用前以去离子水稀释两倍）及5 mL 10%Na2CO3溶液，振荡试管，25 ℃下保温1 h，725 nm 下测定吸光度。总酚含量通过没食子酸标准曲线进行换算，多酚含量表示为mg 没食子酸/g 干物质量。测定3次，取平均值。

总黄酮含量测定参照参考文献[14]。取待测液1mL，加入5%亚硝酸钠1 mL，静置6 min 后再加入10%三氯化铝1 mL，摇匀，放置6 min 后加入10 mL 4%氢氧化钠溶液，以30%乙醇溶液定容至50 mL，在波长510 nm下测定吸光度。总黄酮含量通过芦丁标准曲线进行换算，总黄酮含量表示为mg 芦丁/g 干物质量。测定3次，取平均值。

1.11 感官品评

选取品评员30 名（男12，女18，平均年龄20.8岁），发酵薄荷汁以0∶1、1∶1、1∶0 体积比与新鲜果汁混合。要求品评员对产品的颜色、香气、甜度、涩度及整体可接受度以0～10 分进行打分，其中0 分为接受度最低，10 分为接受度最高。

1.12 数据分析及处理

所有的试验重复至少3 次，数据采用平均值±标准差（Means±SD）表示，以方差分析ANOVA 来检测平均值之间的显著性差异，P＜0.05。用OriginPro 8.0 统计分析数据并作图。

2 结果与分析

薄荷直接榨汁测得总固形物含量（TSS）为6.7°Brix，pH 5.5，这些值与通常用作发酵的水果如苹果（TSS：20.5°Brix）有很大不同。这可能也导致了薄荷发酵时间（40 h 左右）远低于苹果发酵时间（60 h）。将薄荷的不同部位即根、茎、叶作为发酵底物，发酵时间为32 h时测得基质pH 值最低，为3.5，且均在此之后pH 值有所上升。对薄荷不同部位发酵液的总抗氧化性、还原力、自由基清除能力、抗氧化相关成分含量进行分析，并对发酵液进行感官分析，以期为薄荷的发酵产品加工提供参考。

2.1 不同部位薄荷液发酵前后总抗氧化能力、还原力研究

物质总的抗氧化能力是物质清除不同自由基或者是物质的不同活性成分清除不同的自由基的有效和，鉴于物质在机体内起作用的正是其总的抗氧化能力，因此用总的抗氧化能力来评价物质的抗氧化能力是很有必要的。根茎叶对照、发酵液总抗氧化能力及还原力见表1。

表1 根茎叶对照、发酵液总抗氧化能力及还原力Table 1 Total antioxidant capacity and reducing power of control and fermentation broth from roots，stems and leaves

ABTS 法被广泛用于果蔬等物质的抗氧化能力的测定[15]。结果如表1 第一列数据所示，薄荷不同部位未发酵对照及发酵液的总抗氧化能力范围在54.2%～74.9%之间，与未发酵的对照相比，薄荷根、茎、叶发酵液的总抗氧化能力均有所提高，且差异具有显著性。其中根部发酵液的总抗氧化能力要高于其它部位发酵产品，且差异呈现显著性（P＜0.05）。

还原力也是综合评价抗氧化物质提供电子能力的重要指标之一，大量研究证明还原力与抗氧化活性之间存在正相关，一般还原力即OD700值越大，其抗氧化效果越强，因而通过还原力的数值可以综合评价一种物质的抗氧化效果强弱[16]。如表1 第二列数据所示，茎叶未发酵对照及发酵液的还原力间虽存在差距，但差异不具显著性（P＞0.05），而根部发酵液的还原力高于其未发酵对照溶液，且差异具有显著性。本研究中薄荷茎叶发酵前后还原力变化趋势虽与总抗氧化能力相同，但差异不具显著性，而根部发酵后与其它处理相比无论总抗氧化能力还是还原力均显著提高，且差异具有显著性。

2.2 不同部位薄荷液发酵前后自由基清除能力研究

氧化物质进入人体后一般会产生超氧阴离子自由基，该阶段称为自由基形成阶段。超氧阴离子自由基短时间内就会引起连锁反应，这个阶段称为连锁起始反应阶段。衡量抗氧化剂是否能够在连锁起始反应阶段起抑制作用，可通过测定样品清除DPPH 自由基和清除超氧阴离子自由基的方法来确定[17]。根茎叶对照、发酵液DPPH 自由基、超氧阴离子自由基清除率见表2。

表2 根茎叶对照、发酵液DPPH 自由基、超氧阴离子自由基清除率Table 2 The scavenging capacities of DPPH·and superoxide anion radicals of control and fermentation broth from roots，stems and leaves

如表2 所示，根茎叶未发酵的DPPH·清除率在55.0%～64.8%之间，而经过发酵后，不同部位DPPH·清除率均有所增强，在67.7%～70.9%之间，这与Chen 等[18]的研究结果相似，对两种姜属植物（万寿菊和红叶姜）进行发酵，生姜的抗氧化活性和DPPH·清除率平均为70%。与相应未发酵薄荷液相比差异均具有显著性（P＜0.05），但不同部位发酵液间的DPPH·清除率比较接近，差异不具显著性（P＞0.05）。

此外，对超氧阴离子的清除率也是同样情况，3 个部位发酵液的超氧阴离子自由基清除率相似（29.9%～30.4%之间），与DPPH·清除率相比此值偏低，与DPPH·清除率不同的是，根部发酵液超氧阴离子自由基清除率高于未发酵根部薄荷液，且差异具有显著性（P＜0.05），而茎叶薄荷液发酵前后对该自由基清除率间差距较低，且差异均不具显著性（P＞0.05）。

2.3 不同部位薄荷液发酵前后总酚、总黄酮含量研究

从2.1 与2.2 研究结果可看出，薄荷根茎叶发酵前后均具有一定抗氧化能力，可在氧化反应发生的连锁起始反应阶段清除DPPH·及超氧阴离子自由基。乳酸菌在食物发酵中被广泛应用，其中一个众所周知的功能特性如抗氧化性被广泛研究和讨论[19-20]。

为探究起到抗氧化活性的物质，本研究测定了总酚、总黄酮等抗氧化物质的含量，根茎叶对照、发酵液总酚及总黄酮含量见表3。

由表3 所示，薄荷各个部位发酵后，总酚与总黄酮含量均有不同程度提升。其中茎叶发酵后总酚含量与发酵前相比均提高，且差异具有显著性（P＜0.05），但根部总酚含量发酵前后差异不具显著性，需要注意的是，发酵前根部总酚含量要高于茎叶部分，且差异具有显著性（P＜0.05），但发酵后根茎叶的总酚含量差异不具显著性（P＞0.05）。Ng 等[2]研究也发现金线莲发酵前后根茎叶部分的总酚含量也有与薄荷相似的变化趋势，但与其研究不同的是，本研究并未在薄荷发酵液中检出β-胡萝卜素。与总酚含量变化不同的是，根茎叶总黄酮含量在发酵前后均保持相似含量，虽发酵后各部分总黄酮含量均略有提升，但差异不具显著性（P＞0.05）。

表3 根茎叶对照、发酵液总酚及总黄酮含量Table 3 Contents of total phenolics and total flavonoids of control and fermentation broth from roots，stems and leaves

有研究表明，总酚含量与薄荷提取液抗氧化活性呈正相关[21]，因此，前面结论中发酵对照组根部抗氧化性高于茎部、叶部提取液，而发酵组则抗氧化活性相似可能是因为总酚含量变化所导致。

通常，薄荷的消费以茎部及叶部食用为主，部分消费者甚至只食用叶部。根据本研究结论，薄荷根部的高抗氧化活性也应进一步加以利用。

2.4 不同部位薄荷发酵液感官品评

薄荷一般作为新鲜蔬菜用于调味，附加值较低，开发了薄荷的新型利用方法，通过发酵可提高其抗氧化性，将其用作抗氧化剂或开发新型饮料。对薄荷不同部位发酵液进行消费者感官品评，结果如图1 所示。

图1 薄荷发酵液感官评分雷达图Fig.1 Sensory score radar chart of mint fermentation broth

产品消费者接受实验结果表明，根、茎、叶的发酵汁的总体接受度分别为4.9±0.57、5.3±0.82、6.5±0.85，差异不具显著性（P>0.05）。具体来说，各部分甜度、酸度差异较少，且不具显著性（P>0.05），在发酵液颜色方面，根茎差异不具显著性，但叶部发酵液颜色评分较高，且差异具显著性（P＜0.05），即叶部发酵液颜色接受度较高，呈现比较接近薄荷汁的绿色。香气方面，虽可看到叶部香气评分较高，但差异不具显著性（P>0.05）。

总体来说，与未经发酵薄荷汁相比，各部分发酵液香气有所下降，但更为缓和，冲击力较低，消费者接受度更高，且甜味均较为明显。许多研究利用水果或蔬菜作为发酵底物，而以传统草本植物作为发酵底物研究较为少见。这种新型利用方式不仅解决了薄荷大量生产且附加值较低的情况，也为草本植物的利用提供了新思路。

3 结论

本研究以薄荷为原料以嗜酸乳杆菌进行发酵，对发酵前后总抗氧化性、清除自由基能力，抗氧化物质含量进行分析，并对发酵液进行感官品评分析，结果发现发酵后根茎叶发酵液总抗氧化性、清除DPPH·及超氧阴离子自由基的能力均上升，且与发酵前差异具有显著性（P＜0.05），而对发酵前后总酚、总黄酮等抗氧化物质含量分析发现，根茎叶总酚总黄酮含量在发酵后均上升，且茎叶与发酵前相比差异呈现显著性（P＜0.05）。最终发酵产品，只叶部颜色与根、茎差异呈现显著性，其他指标差异均不具显著性（P>0.05）。

薄荷根部的发酵后的抗氧化活性、清除自由基能力应引起重视，在产品加工中加以利用。此外，嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus 对胃肠道消化有良好的作用，增加了其作为发酵接种物的价值。本研究提出一种新的利用传统草本植物薄荷的方法，将有助于亚洲地区的医疗价值的商业化和推广。