利用微卫星标记分析青紫蓝獭兔的保种效果

申金钰，陈 实，赵 斌，李佳丽，卢婷婷，翁巧琴，鲍国连，陈 阳，吴信生*

（1.扬州大学动物科学技术学院，农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州 225009；2.浙江省余姚市欣农兔业有限公司，浙江宁波 315400；3.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021）

獭兔，又名力克斯兔，意为“兔中之王”，是皮肉兼用型兔，因其皮毛酷似珍贵的毛皮兽水獭而得名。獭兔具有外貌匀称，耳朵长，须眉卷曲，毛绒短、平、密、细、美、牢等特征[1-2]，其毛色天然纯正，手感柔软滑爽，在国际、国内市场上销售前景广阔，特别是青紫蓝獭兔，被毛为蓝灰色，吹开被毛呈现彩色轮状漩涡，十分美观，颇受消费者青睐[3-4]。我国现存的青紫蓝獭兔数量甚少，本团队经过长期进行遗传资源的搜集与选育工作，已经建立了青紫蓝獭兔的资源群体，为本研究的开展提供了研究素材[5-6]。

分子标记技术诞生于20 世纪80 年代，实现了从表型选择到基因型选择的飞跃。其中由liit 和luty 命名的微卫星标记具有分布均匀、保守性高、多态性丰富、突变率较低、简易性、呈共显性遗传特点，目前在家兔的遗传多样性评估上已有一些应用。朱玉峰等[7]利用微卫星标记等分析Vc 獭兔的群体遗传结构和遗传稳定性。申幸娇等[8]采用18 个微卫星位点（Sat2、Sat5、Sat8、Sat12、Sol33、Sol44、6L1F10 等）检测国内日本大耳白兔、青紫蓝兔等的遗传背景及遗传结构，研究表明这18 个微卫星位点遗传多样性较高，种群间分化明显。微卫星标记已被广泛应用于家兔遗传育种，但其在家兔分子研究中应用较少，尚无实质性突破。相对于国外的家兔领域研究，微卫星标记的推广起步晚，研究也较浅。目前我国彩色獭兔数量少，品种质量差，毛色遗传不稳定等，很难形成高规格批量供货，成为我国彩色獭兔发展的主要限制因素。本研究基于已有的青紫蓝獭兔资源群体，研究多个世代保种后的群体遗传多样性的变化，筛选出23 个微卫星位点，分别统计1、4、5 世代的遗传多样性参数，建立起青紫蓝獭兔保种选育的数据库。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验取用青紫蓝獭兔3 个世代的耳组织样，分别选取1、4、5 世代獭兔群体，每代各取60 只，共计180 只，所采耳组织样均来源于余姚欣农兔业有限公司。

1.2 实验试剂与仪器

1.2.1 实验试剂 总RNA 提取试剂盒（DP419），购于天根生化科技（北京）有限公司；Tris 饱和酚、异丙醇均购于北京鼎国生物技术公司；琼脂糖购于SIGMA 有限责任公司；脱氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA 聚合酶均购于Invitrogen 有限责任公司；Tris base、DL2000、SDS、EDTA、去离子甲酰胺、硝酸银、亚甲基双丙烯酰胺等均购于上海生物工程有限责任公司。

1.2.2 实验仪器 ND-1000 浓度测定仪、BD-255LTB型低温冷冻柜、制冰机、Eppendorf 移液枪、DYCZ-21 型电泳槽、AB1-3730XL DNA Analyzer 测序仪、小型Eppendorf AG-22331Mini 式高速离心机、电泳槽DYCZ-24A、Image Quant Capture3000 成像系统、DK-600 型电热恒温水槽、高压灭菌锅、Eppendorff Centr5ge5415R 冷冻离心机等。

1.3 实验方法

1.3.1 青紫蓝獭兔耳样采集 用剪刀取1 cm3兔耳组织，放入1.5 mL 离心管中，置于-20℃下冷冻保存、备用。

1.3.2 青紫蓝獭兔基因组DNA 提取 根据试剂盒操作说明来提取青紫蓝獭兔基因组总DNA。DNA 提取后，用NanodropND-1000 全波长的分光光度计测定溶解后原液的DNA 浓度，根据测定结果取部分原液统一稀释至100 ng/ L，4℃保存备用，剩余原液置-20℃保存。

1.3.3 筛选微卫星引物及PCR 扩增 查阅相关参考文献[9-12]发现SSR 标记位点数较少，本实验从中筛选23 个具有代表性的SSR 标记位点，分别分布在19 个不同染色体上，由上海生工生物技术服务有限责任公司合成引物。PCR 反应程序为在冰浴中，将PCR 所需成分依次加入无菌0.5 mL 离心管。调整PCR 仪反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置于PCR 仪进行扩增。PCR 扩增程序：95℃预变性5 min，94℃变性45 s，50～64℃退火40 s（因位点而异），72℃延伸40 s，共34 个循环，72℃延伸l0 min 至4℃保存。PCR 反应总体系为20 μL：l0×PCR（Mg2+free）Buffer 2 μL，25 mmol/L MgC120.8～1.2 μL，2.5 mmol/L dNTPs l.0 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，Taq DNA 聚合酶1.0 U，100 ng/μL DNA 模板1.0 μL，双蒸水补至20 μL。通过1%的琼脂糖凝胶电泳和SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR 扩增产物进行检测，从而筛选出符合条件的引物。

1.3.4 荧光标记引物PCR 扩增 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得到青紫蓝獭兔基因型图，根据GenBank数据库公布的微卫星位点目的片段长度，以等位基因大小为参数，当产物相差20 bp 以上，在测序时等位基因片段长度区别比较大，信号容易区分，因此把相差20 bp 以上的SSR 位点进行组合，每3 个位点一组；用FAM（蓝色）、TAMRA（黄色）、HEX（绿色）3 种荧光染料分别对上游引物5’端进行荧光标记，共计15个标记组合，由上海生工生物技术服务有限责任公司进行合成（表1）。对23 个荧光SSR 标记引物进行单一PCR 扩增处理后，再对不同的PCR 产物混合样进行STR 分型检测，获得STR 电泳图谱。

1.3.5 统计分析 使用微卫星序列分析软件Genemapper 4.0，选择Microsatellite 为分析方法，建立Genemapper分析项目，导入獭兔混合样的电泳结果进行数据分析，分析完成后导出每个微卫星位点的峰图，根据每个样本的测序图谱结果自动连续地读出对应的扩增产物浓度、片段大小等数据，通过峰图判断同一位点上的2 个等位基因是否相同，单峰表示相同，代表纯合子，双峰表示杂合子，用Excel 表记录每个位点的不同样本峰图，青紫蓝獭兔第1 世代的23 个SSR 位点在个体中的分布位置；利用PopGene 软件对青紫蓝獭兔各遗传多样性参数进行统计分析；采用SPSS 20.0 软件进行不同世代青紫蓝獭兔各遗传多样性参数分析，具体包括等位基因数（A）、有效等位基因数（Ae）、期望杂合度（He）、观测杂合度（Obs He）和多态信息含量（PIC），以P＜0.05 作为差异显著标准。

2 结果与分析

2.1 DNA 提取及PCR 产物结果检测 提取青紫蓝獭兔全基因组DNA，使用Nanodrop ND-1000 浓度测定仪测定所提取DNA 的纯度和浓度，并记录数据。此外，检验所得的PCR 扩增产物与预期结果一致，约为250 bp。

2.2 SSR 荧光标记毛细管电泳检测 检测结果表明等位基因的片段长度在88～456 bp，均小于500 bp（图1）。图1 是INRACCDDV0313（HEX）、6L2H3（FAM）和INRACCDDV0309（TAMRA）3 个SSR 位点的毛细管凝胶电泳结果。

2.3 3 个世代的遗传多样性分析 由表2 可知，青紫蓝獭兔3 个世代的A 分别为3.173 9、3.087 0 和3.173 9，Ae 分别为2.104 3、1.984 7 和1.877 1，遗传多样性较为丰富。1 世代Obs He 为0.517 4（Obs He＞0.5），遗传变异程度较高，表明兔群对环境的适应能力强；3 个世代的PIC 在0.357 4～0.387 8，呈中度多态，说明兔

群遗传变异程度较高，其中多态性最高的是1 世代，多态性最低的是5 世代。各世代保种群Obs He 较高，均在0.493 5～0.542 0。其中4 世代保种群Obs He 最高，5 世代保种群最低，但3 个世代之间无显著差异。

表1 荧光标记SSR 引物23 个位点组合及反应条件

图1 SSR 位点毛细管凝胶电泳结果

青紫蓝獭兔3 个世代的各遗传参数差异不显著，浙江余姚保种场的保种效果良好。

表2 23 个微卫星位点下青紫蓝獭兔3 个世代各遗传多样性参数统计

3 讨 论

家兔保种是指保存一切与特定生态条件相联系的基因及基因组合体系，使家兔品种基因库中的每一优良基因都不丢失。家兔品种保存方法包括冻精、冻胚和活畜相结合等，目前以活畜保种为主。通过基因库活体保存技术对优良家兔种质资源集中保存备份，以便利用基因库开展相关研究。

本研究利用筛选出的23 个SSR 位点组合对青紫蓝獭兔基因库保种群体的遗传变异情况进行相关检测，可为日后在家兔保种领域的研究提供一定依据。遗传多样性一般指种内个体间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。Ae 反映某等位基因分布的均匀程度，其数值越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀[13]。杂合度即基因的多样性。群体杂合度（Heterozygosity）指随机抽取的2 个样本的等位基因不相同的概率，可作为检测品种遗传变异的指标[14-15]。PIC 表示一个后代所获得某个等位标记来自于父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性，是表示DNA 变异程度高低的一个指标。高度多态位点PIC 在0.5 以上，中度多态位点PIC 在0.25～0.5，低度多态位点PIC 低于0.5。

很多学者基于相关原理对群体间的遗传变异情况进行判断。陈民利等[16]对大耳白黑眼兔封闭群与日本大耳白兔、新西兰兔的微卫星多态性进行对比，发现了区分大耳白黑眼兔与其他品系的特有等位基因。俞春英等[17]检测了25 只福建黄兔在15 个微卫星位点上的遗传变异情况，比较Ae、He 和PIC 等遗传参数，对福建黄兔遗传多态性进行了分析。谢喜平等[18]选择了16个微卫星标记，统计了Ae、PIC、He 等遗传参数，从DNA 分子水平揭示了福建黄兔群体遗传多样性和遗传结构。目前国内对青紫蓝獭兔保种效果相关的微卫星标记研究较少，本研究选择了23 个微卫星位点研究青紫蓝獭兔的遗传多样性，表明了青紫蓝獭兔群体的遗传多样性较为丰富，3 个世代之间无显著差异。此外，实验还需扩大样本量，进一步提高样本的代表性及各遗传多样性参数稳定性。

4 结 论

本研究使用的23 个微卫星位点（So144、12L4A1、6L1F10、6L3F8、D3Utr2、7L1B10、19L1C5、So133、So103、12LIE11、L8B5、D7Utr5、So162、Sat2、INRA CCDDV0007、INRACCDDV0087、INRACCDDV0185、INRACCDDV0190、INRACCDDV0192、INRACCDDV 0256、INRACCDDV0346、INRACCDDV0160、INRACCDDV0157）具有中度多态性，可用作遗传多样性分析有效遗传标记，兔群3 个世代的Obs He 都高于He，均在0.5 左右，表明青紫蓝獭兔群体有较丰富的遗传多样性，同时，浙江余姚欣农兔业有限公司的保种模式和方案得当，保种效果良好。