骨形态发生蛋白-2（BMP2）基因的生理功能和信号通路研究进展

费晓娟，金美林，卢曾奎，狄 冉，魏彩虹*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050）

绵羊是重要的家畜之一，拥有11 000 年的驯化史，是史上第一个被驯化的游牧动物。根据绵羊尾型可分为短瘦尾羊、长瘦尾羊、短脂尾羊、长脂尾羊和肥臀羊五类[1]。肥尾羊大约在5 000 年前从瘦尾羊中演化而来，目前肥尾羊数量已占全世界总羊数的四分之一[2]。本实验室前期的研究表明，在哈萨克羊（肥尾羊）和藏羊（瘦尾羊）脂肪组织中有464 个基因差异表达，其中BMP2基因与绵羊脂尾的发育有关[3-5]。进一步研究表明，BMP2基因能够促进绵羊前体脂肪细胞的分化，参与绵羊尾部脂肪沉积，从而影响绵羊尾型发育[6]。

1965 年 Urist 在成人的脱钙骨基质中提取出一种能诱导异位骨发生的活性蛋白，并根据其生物学特性命名为骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMPs），属于转化生长因子β（The Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族[7]。BMPs 家族成员至少有40 个，目前关于骨代谢的研究最多[8]。BMPs 家族被分为5 个亚型，其中，BMP2与骨的生长和分化相关，属于第一类亚型[9-10]。BMPs 是一种参与生物机体机能发生和调节的分泌蛋白，与细胞增殖和分化、细胞凋亡、形态发生、器官形成等相关[11]，BMP2同样具有广泛的生物学功能[12-17]。本文就BMP2基因的结构和功能及其参与的信号通路等进行综述，为进一步研究BMP2基因提供理论依据。

1 BMP2 基因的发现和结构

1988 年Wozney 等[18]首次克隆出了人的BMP2基因，由3 个外显子和2 个内含子组成，且该基因翻译起始于第2 外显子结束于第3 外显子[19]。研究表明，不同物种的BMP2基因的编码区序列同源性较高[20]。采用Needle 工具（https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）比较不同物种BMP2基因编码区核苷酸的同源性（表1），绵羊与牛的BMP2编码区核苷酸的同源性最高；山羊与猪、牛和鸡的BMP2编码区核苷酸序列同源性较高，均在50% 以上；绵羊与鸡的BMP2编码区核苷酸序列同源性最低。

BMP2 蛋白属于疏水性蛋白，是由信号肽、前体蛋白和成熟结构域组成的较大前体蛋白。蛋白分泌后去除信号肽，前体蛋白发生二聚，然后特异性蛋白水解酶将二聚后的前蛋白裂解，释放成熟区域。成熟区域可以与自身或者其他BMP 蛋白二聚，生成具有生物活性的二聚成熟蛋白，从而发挥生物学功能[21]。成熟的BMP2蛋白是由2 个114 肽亚单位通过二硫键共价连接的同二聚体[22-23]。在BMP2 蛋白的羧基末端有一段由 7 个半胱氨酸残基形成的保守区域，其中 6 个半胱氨酸形成了3 个分子内二硫键，第7 个半胱氨酸残基通过二硫键发挥二聚作用[23]。此外，BMP2单体的核心是一个半胱氨酸结，由8 反向平行的β-折叠和一个α-螺旋形成，且每个单体只有2 个色氨酸残基，在骨的修复和诱导过程中发挥重要的作用[10-11]。

表1 不同物种之间BMP2 基因编码区核苷酸序列的比较

2 BMP2 基因的表达

BMP2基因在人和动物的不同器官中均有不同程度表达[24-25]。小鼠BMP2基因在胚胎期的表达模式为胚胎外区域在第6 天[28]、羊膜的中胚层细胞在第8.5 天[11]、背部神经管的外胚层在第8.5～9.5 天[11]、心脏的外心肌层和脊椎顶部的外胚层在第9.5～10.5 天[11]、眼睛、牙齿和胡须在第12.5 天[11]表达。与正常组织相比，BMP2在癌细胞中高表达，可作为人类癌症、肿瘤等疾病的检测标志物[26]。BMP2基因同样在健康组织中表达，如在鲤鱼的鳃、肠、肝、脾、脑和血液中都有较高的表达水平，与鳍的发育或再生相关[27]。

3 BMP2 的生理功能

BMPs家族通过TGF-β超家族的I 型受体和II 型受体传递信号发挥生物学功能，目前在哺乳动物中发现TGF-β超家族有7 种Ⅰ型受体和 5 种Ⅱ型受体，且均具有丝苏氨酸激酶活性[29]。BMPs 家族受体由一个短的胞外结构域、一个单一的跨膜结构域和一个具有活性丝氨酸/苏氨酸区域的胞内结构域三部分构成[23]。BMPs家族受体包括3 种Ⅰ型受体BMPIA型受体、BMPIB型受体和激活素受体（如kinase、ACVRI 和 ALK2 等）；3 种Ⅱ型受体BMPRII、ActRIIA 和ActRIIB。BMPs 蛋白分泌后，BMPs 配体与II 型受体结合并磷酸化I 型受体，随后再磷酸化下游转录因子，形成复合物并转移到细胞核，启动相关基因转录，从而调节细胞的增殖和分化等生命活动[30-31]。

3.1BMP2与骨形成BMP2属于特异成骨基因，现已被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于脊椎融合的临床治疗中。BMP2在骨形成的过程中，受其他因子影响。Chio 等[32]在大鼠骨质疏松症体内模型中观察到维生素C 使BMP2的表达增强，抑制大鼠骨质疏松症的发生。此外，Kovermann 等[17]研究表明，含有BMP2的体外培养基能够诱导人滑膜源性干细胞形成软骨，在含有TGF-β1 和BMP2的联合培养基中与软骨形成相关的聚蛋白多糖（Aggrecan，ACAN）的表达也显著上调，更加促进软骨形成。此外，BMP2/7异二聚体蛋白联合低浓度的全反式维甲酸（All-Trans Retinoic-Acid，ATRA）可使小鼠骨髓源巨噬细胞中破骨细胞生成相关基因的表达下调，阻断破骨细胞生成并降低破骨细胞的吸收活性[33]。综上，这些因子与BMP2之间形成调控骨发生的网络，为骨疾病的治疗提供新的见解。

3.2BMP2与脂肪沉积 将人的骨髓源性干细胞提取、分离并在三维成骨或成脂培养基中培养，结果显示在补充了BMP2的三维培养基中形成的脂滴明显多于其他培养基[34]。对547 例不同体重指数个体的内脏和皮下组织检测，发现在肥胖人群中内脏组织和皮下组织中BMP2的表达显著高于健康人群[35]。在体外研究大鼠的肌腱干细胞中脂肪生成机制的过程中，BMP2可磷酸化并激活下游的环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMPresponse Element Binding Protein，CREB）和Smad 蛋白，随后上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ2，PPARγ2）的表达，从而增强肌腱干细胞脂肪分化的趋势[36]。这些结果与Birgit 等[37]的研究结果一致，均表明BMP2与组织中脂肪沉积相关。

本课题组使用Illumina Ovine SNP50 芯片，对10个本土绵羊品种进行群体结构分析和基因组选择分析，发现这些地方品种分为肥尾和瘦尾2 种类型；用FST和hapFLK 方法分析发现BMP2基因与绵羊尾型的发育有关[4-5]，并确定BMP2可作为绵羊尾型发育的关键候选基因[38]。此外，有报道称BMP2可以促进猪前体脂肪的分化[14]。本课题通过构建慢病毒载体，将BMP2基因过表达于绵羊前体脂肪细胞中，发现BMP2基因在mRNA 水平过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ，PPARγ）和脂蛋白脂酶（Lipoprteinlipase，LPL）均上调，但是蛋白表达水平差异不显著，推断BMP2同样能够促进绵羊前体脂肪细胞的分化，参与绵羊尾部脂肪沉积，影响绵羊尾型发育。但是其作用机制尚不清楚，需要进一步研究[6]。

3.3BMP2与生长发育BMP2是细胞分化和增殖过程中重要的介质，BMP2的表达水平与细胞的增殖和凋亡息息相关。以肠缺血再灌注大鼠为模型，分别在24 h和48 h 处死，发现灌注大鼠的空肠中BMP2基因和蛋白的表达均显著上升，且空肠和回肠的细胞数量增加[39]。同时BMP2通过不同途径促进小鼠星形胶质细胞分化，小鼠大脑皮层星形胶质细胞经过BMP2处理后，激活了转录共激活因子相关蛋白（Yes-associated Protein，YAP），并与Smad1/5/8 蛋白相互作用并稳定Smad1/5/8 蛋白的表达，从而促进小鼠大脑皮层星形胶质细胞的分化[39]；在小鼠神经干细胞中发生DNA 损伤的模型中，BMP2通过激活Janus 激酶/信号转导与转录激活子（The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions，JAK-STAT）信号通路，上调星形细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）的表达，同样促进衰老细胞的星形胶质细胞的分化[40]。此外，当过表达miR-378 时可激活BMP2基因参与的BMP-Smad 信号通路，促进绵羊成肌细胞的增殖[41]。

BMP2还对胚胎发育过程中器官的形成产生影响，对胚胎发育是否畸形起决定性作用。用逆转录病毒RASC-BMP2感染鸡胚中肠，发现在鸡胚肠道形成更紧密的卷曲环，每个循环管的长度和半径显著减少；肠系膜背侧的细胞密度增加，并且其面积明显减小[42]。在小鼠胚胎发育过程中，BMP2残缺会导致前羊膜腔不能闭合，形成畸形羊膜，同时也会造成小鼠心脏发育缺陷[43]。

3.4BMP2与癌症 近年来的研究表明，BMP2既可以促进癌症的发生又可以抑制癌症的发生，这可能是由于细胞种类或者细胞所处的环境不同，从而出现这一矛盾的结果。在乳腺癌细胞系MCF-7 中发现，BMP2基因启动子甲基化使BMP2表达下调，增强了乳腺癌细胞的耐药性，促进癌症发生[44]。而将小鼠和人的乳腺癌细胞MCF-7 分别用BMP2处理，结果显示BMP2抑制癌细胞的迁移和增殖[45-46]。在鼻咽癌中，sox9与BMP2启动子结合，增强了BMP2表达，进而激活了BMP2诱导的mTOR 信号转导，促进鼻咽癌中癌细胞的增殖、迁移和侵袭[47-48]。在小鼠慢性胰腺癌细胞发现BMP2可增强miR-200 的表达，抑制慢性胰腺癌细胞纤维化[49]。此外，激活素A 直接抑制BMP2诱导的多发性骨髓瘤细胞系的抗增殖活性，通过设计BMP2变异体，发现该变异体对特定的II 型受体表现出增强的受体结合亲和力，进而促进骨生长，这为多发性骨髓瘤的治疗提供新的思路[50]。

4 BMP2 参与的调控通路

4.1BMP2与PI3K/Akt 信号通路 磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路调节细胞的生长发育，同时介导多种癌症的发生。在含有胎牛血清的培养基中培养小鼠前骨细胞，发现BMP2只需要磷酸化Akt位点Ser473，就可以促进成骨细胞分化；在不含胎牛血清的培养基中，BMP2需要磷酸化Ser473 位点并使Akt的Thr308 位点去磷酸化来增加成骨细胞的分化[51]。在胰腺癌细胞系panc-1 和胃癌细胞中，BMP-2刺激上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的发生，同样使PIK3下游因子Akt发生磷酸化，从而促进癌细胞的运动和侵袭[52]。可见，BMP2对Akt的磷酸化，是激活PI3K/Akt 通路的关键。此外，在无血清培养基中培养小鼠软骨细胞系N1511，并加入50 ng/mLBMP2，发现BMP2能够通过PI3K/Akt 抑制细胞的凋亡，深入研究发现BMP2通过激活PIK3信号，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达[53]。

4.2BMP2与Smad 信号通路 Smad 信号通路是BMP2的经典通路，BMP2蛋白分泌后，配体与II 型受体结合并激活I 型受体的丝苏氨酸激酶活性位点，随后启动Smad 家族蛋白质的信号级联。具体来说是Smad1/5/8被BMP2受体复合物磷酸化，然后与Smad4 结合形成Smad1/5/8Smad4 复合物，复合物再向细胞核内转运，随后以组织和发育阶段特有的方式启动基因转录，从而调节细胞的生命活动[54-55]。该通路涉及到BMP2介导的多种细胞调节活动。Ahsan 等[56]将恶性外周神经鞘瘤（Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors，MPNSTs）细胞用BMP2 I型受体抑制剂LDN-193189 处理，发现Smad1/5/8 的表达下调，并且MPNSTs 细胞的活性和侵袭性显著降低，抑制了MPNSTs 细胞的恶性扩散。在脊椎动物胚胎心脏前体细胞中BMP2和Wnt信号通路下游因子糖原合成酶激酶3β（Glycogen Synthase Kinase 3 beta，GSK3β）促进Smad1 磷酸化，调节心脏前体细胞的迁移轨迹，促进心脏的形成[54]。在颅骨缺损模型中发现，胞外钙离子可增强BMP-2对Smad 信号通路的磷酸化，使骨钙素、成骨特异性转录因子（Runt-related Transcription Factor2，Runx2）和成骨相关转录因子（Osterix，Osx）的表达上调，促进了体内骨再生[57]。

4.3BMP2与MAPK 信号通路 促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPKs）包括应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）、细胞外信号调节激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）和p383 个亚族[58]。该通路同样参与癌症的发生，体内外试验表明抑制BMP2的表达或者抑制p38 的表达会抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭以及微血管密度和血管生成[59]。同时BMP2通过该通路调节细胞分化，在C2C12 间充质干细胞中发现Runx2上游因子p38被BMP2激活，使Runx2的表达上调，促进间充质前体细胞的分化[60]。将原代小鼠颅源性成骨细胞在BMP2培养基中诱导培养，并抑制p38的表达，碱性磷酸酶活性也会降低；抑制JNK 的表达，骨钙素的表达明显下调，从而影响骨分化[61]。此外，Yang 等[62]研究发现，BMP-2磷酸化JNK，可以增强成骨细胞分化。

4.4BMP2与PPARγ信号通路PPARs是具有调节血糖和脂质平衡的一种过氧化物酶体增殖物激活受体，是一种核激素受体和转录因子，包括PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ3种亚型[63]。PPARγ通路在不同的细胞中调节细胞的增殖和分化，在细胞生命活动中起重要的作用。在间充质干细胞中PPARγ的激活能够增强Runx2启动子的组蛋白激活标记来影响BMP2的作用，同时PPARγ靶基因启动子的组蛋白激活标记的表达在一定条件下也可通过BMP2刺激而提高，因此BMP2与PPAR-γ信号通路是相互交叉的，共同调节细胞活动[64]。通过构建慢病毒载体过表达BMP2与前体脂肪细胞中发现，PPARγ的表达显著上调，促进前体脂肪细胞的分化[6]。此外，在血管平滑肌细胞中PPARγ通过连接上游因子TGF-β1 和BMP2，协同调节细胞增殖和糖代谢[65]。

5 总结及展望

BMP2基因从发现至今取得了较大的研究进展，其在组织中的生物学功能基本被明确。BMP2作为最活跃的骨生长因子，现已被应用于临床治疗。目前的研究发现BMP2在成骨过程中与其他生长因子或成骨基因之间相互作用形成成骨调控网络，这为临床骨治疗提供新的思路。同时BMP2在癌细胞内广泛表达，可作为检测癌症的标志物，BMP2基因既可以促进癌细胞的增殖与扩散，又能抑制癌细胞的增长。同样地，在BMP2介导的癌症发生的多条信号通路中，也存在抑制或促进癌细胞的迁移、扩散和增殖，针对这一矛盾结果，还需要深入研究。本实验室前期研究表明BMP2可能与绵羊尾部脂肪沉积相关，影响绵羊尾型的发育。进一步的研究表明BMP2基因能够促进绵羊前体脂肪细胞的分化，但是机制尚不明确。后期研究将集中于BMP2在绵羊尾部脂肪沉积的调控机理，为培育不同尾型的绵羊提供理论基础。