CYP2E1和CYP1A1基因型与广州北部地区人群HBV易感性间的相关性分析

洪晓绿 徐沛演 潘小平

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个重要的全球卫生问题，特别是在发展中国家，有较高的发病率和病死率，我国HBV感染率约为7.18%[1-2]。HBV自身的感染力与宿主之间的相互作用对HBV的感染、复制和病情进展均有显著影响，宿主中的某些基因可能对HBV感染的结局起关键性作用，与药物代谢相关的基因如细胞色素P450(CYP)酶可能在乙型肝炎的发生发展中发挥重要作用[3-5]。虽然CYP基因分型在肝细胞癌(HCC)中的作用比较明确，但CYP2E1和CYP1A1基因分型在HBV感染患者中的生物学作用还不甚明了。本研究分析CYP2E1 和 CYP1A1基因分型与广州北部地区人群HBV易感性间的相关性，为HBV的检测、诊断、预防提供新的实验依据。

资料与方法

一、临床资料

随机选取2019年11月1日至2020年1月31日在广州市花都区人民医院就诊的HBV感染者150例作为实验组，男性96例，女性54例，年龄为(40.2±12.9)岁；另外选取同期体检健康人群150名作为对照组，男性105名，女性45名，年龄为(30.8±10.1)岁，两组年龄差异无统计学意义(t=2.492，P=0.271)。

纳入标准：所有病例均符合2015年中华医学会肝病学分会及感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》诊断标准[6]，并结合症状、体征及实验室影像学检查，符合其诊断标准，健康体检志愿者未携带肝炎病毒。

排除标准：①与其他病毒性肝炎重叠感染者；②合并其他慢性肝病者，③合并肝恶性肿瘤或其他脏器恶性肿瘤者；④其他重要脏器功能不全者。本研究经本院伦理委员会审核批准且所有受试对象均获得知情同意。

二、方法

(一)标本采集及处理 采集实验组所有受试者清晨空腹静脉血5 mL，取2 mL置于EDTA抗凝管中，按照DNA提取试剂盒(DP705-01，北京天根)提取DNA，紫外分光光度仪测定其A260/A280值1.7～1.9，剩余3 mL静脉血置于干燥管中，3 500 r/min离心10 min，分离血清检测ALT、AST、GGT、TBil、AFP、HBV DNA；按上述方法提取对照组所有受试者DNA，紫外分光光度仪检测DNA纯度。

(二)PCR扩增 采用Beacon Designer8软件设计引物序列见表1，由上海生工生物工程有限公司合成，在PCR仪(2720 thermal cycler，ABI)上扩增。50 μL反应体系为DNA 1 μL、TSINGKE Mix 45 μL、引物F 2 μL、引物R 2 μL。扩增条件：98 ℃ 2 min，然后98 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s，共35个循环，72 ℃ 5 min。2 μL样品+6 μL溴酚蓝(B8120，Solarbio)混合后0.8%琼脂糖电泳(300 V，12 min)，各目的片段条带清晰，片段大小相符；采用PCR产物纯化(磁珠法)试剂盒(DP219-03，北京天根)纯化PCR扩增产物。

表1 rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843扩增引物序列

(三)SnapShot法检测 SNP单链延伸所需的中间引物见表2。将5 μL反应体系(纯化后的PCR产物1 μL， SnapShot multiplex Mix 2 μL，Primer Mix 2 μL)，于PCR仪(2720 thermal cycler，ABI)上扩增，反应条件：96 ℃ 10 s；50 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s共25个循环，4 ℃延伸保存。取1 μL扩增产物，加入10 μL 120Liz HIDI (00815746，ABI)，95 ℃变性5 min，-20 ℃冷却2～3 min，采用测序仪(3730XL，ABI)检测，Genemapper4.0分析结果。

表2 rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843单链延伸引物

三、统计学方法

两组各基因型均进行Hardy-Weinberg检验，计算各组等位基因型分布频率，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各基因型Hardy-Weinberg检验

根据Hardy-Weinberg平衡定律公式：[p(A)+q(a)]2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa)，计算H-W期望值，然后经χ2检验，结果显示，所有基因型P>0.05，所有基因型均符合哈代-温伯格定律，具备群体代表性。见表3。

表3 rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843基因型Hardy-Weinberg检测

二、两组间基因型分布频率比较

CYP2E1基因rs3813867 GG、GC、CC 3种基因型，rs2031920 CC、CT、TT 3种基因型的分布频率在实验组和对照组间差异均有统计学意义(P<0.05)；实验组rs3813867基因CC基因型和rs2031920基因TT型分布高于对照组且差异有统计学意义(均P<0.05)。而CYP1A1基因rs4646421 GG、GA、AA 3种基因型和rs2198843 GG、GC、CC 3种基因型的分布频率在两组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 两组间rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843基因型分布频率比较

三、不同临床指标时CYP2E1基因rs3813867和rs2031920基因型分布频率

在各临床指标中，CYP2E1基因rs3813867和rs2031920基因型分布频率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表5 不同临床指标时CYP2E1基因rs3813867和rs2031920等位基因分布频率

讨 论

CYP450酶系属于单加氧酶，主要存在于质膜、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、核膜等细胞器的膜中，具有解毒作用，与药物代谢密切相关[7]。CYP450酶是一组由许多同工酶组成的超基因大家族，以铁卟啉为辅基，主要分布于肝脏，人类编码CYP450的基因有18个基因家族，43个亚家族，57个基因[8]。

细胞色素P4502E1(CYP2E1)酶和CYP1A1酶是CYP 450酶超家族成员，对许多有毒物质的代谢起重要作用，其均表达于肝脏，是肝脏中主要的CYP450亚型[9-10]。CYP2E1基因有多种变异体，这些变异体与多种不同类型癌症的易感性增加或降低有关，如鼻咽癌[11]、膀胱癌[12]、肺癌[13]等；CYP2E1基因变异体(rs3813867 和 rs2031920)与鳞状细胞癌[14]、结直肠癌密切相关[15]；CYP1A1酶是催化多环芳烃(PAHs)代谢所必需的酶，其两个基因变异体与吸烟者肝癌的风险有关[16-17]，在HBV易感人群中鲜见报道。

本研究对150例HBV感染者和150例健康对照组CYP2E1和CYP1A1基因rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843的多态性进行了研究，结果表明，CYP1A1基因rs4646421和rs2198843基因型分布频率在HBV感染者与健康对照组间差异无统计学意义。通过对CYP2E1基因rs3813867基因型分析发现，HBV感染者CC基因型分布频率高于健康对照组，CC基因型个体的肝炎发展风险是GG基因型个体的5.59倍，而CYP2E1基因rs2031920 TT基因型分布频率HBV感染者高于健康对照组，TT基因型个体的肝炎发展风险是CC基因型个体的3.57倍。本研究与Fattahi等[18]的研究结论不一致，其原因可能为研究的人群不同，携带的基因型以及基因分布频率不同。

Nakai等[19]发现，慢性丙型肝炎感染与药物代谢酶如CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4有关。Makpol等[20]研究提示马来西亚人群中CYP1A1基因变异与肝癌风险之间存在显著关系。Yu等[21]研究表明CYP1A1变异在多环芳烃的致癌作用中起重要作用。Li等[16]研究表明rs2198843和rs46464233变异携带者有较高的肝癌风险。而本研究表明，rs3813867位点有CC基因型，rs2031920有TT基因型的个体更易感染HBV。

综上所述，CYP1A1基因rs4646421和rs2198843位点基因分型与广州北部地区人群HBV易感性无关，CYP2E1基因rs3813867和rs4646421位点基因分型与广州北部地区人群HBV易感性密切相关。