白细胞介素-6在大鼠肝肺综合征发病机制中的作用

王立国 郭月宁 刘喃喃

肝肺综合征(hepatopulmonmy syndrome HPS)是在慢性肝病基础上形成的以肺微血管扩张、低氧血症为主要特征的一种疾病，是终末期肝硬化患者最严重的并发症，成人终末期肝病患病率为4%～47%，发病机制未完全阐明，治疗效果差，病死率高[1-2]。目前多数研究认为，低氧血症是HPS发病的重要原因，高压氧可治疗大鼠HPS[3]。低氧血症的病理生理基础是肺微血管扩张[4]。引起肺微血管扩张的因素很多，目前研究主要集中在血管活性物质方面，如一氧化氮(nitric oxide,NO)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factors,TNF-α)、一氧化碳(carbon monoxide,CO)等，通过不同途径促进肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC)增殖，引起细胞通透性增强，从而导致肺微血管扩张而产生低氧血症。

研究表明，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在免疫调节、造血、炎症与肿瘤发生方面具有广泛生物学活性，其可以联合WBC及NLR值作为评估慢加急性肝衰竭患者早期预警指标[4-6]。细胞因子多数通过结合特定受体并激活一些信号转导通路而发挥调控作用。IL-6/JAK2/STAT3信号通路是一条重要的转导通路，被广泛报道参与到细胞增殖过程中，在细胞周期、细胞增殖领域中具有良好的研究基础。本实验通过建立大鼠HPS模型，体外分离培养PMVEC，研究IL-6对肺微血管细胞增殖的作用，并阐明IL-6/JAK2/STAT3信号通路在HPS发病机制中的重要意义。

资料与方法

一、动物、仪器和试剂

Wistar大鼠40只，体质量为180～ 250 g[实验动物生产许可证编号：SCXK(鲁)20130001]；PCR仪购置ABI Biosystems公司，型号ABI7000；流式细胞仪购置美国BD公司，型号FAC-Scan；超声采用加拿大Sonix OP诊断系统；低糖DMEM培养基为美国PAA公司；植物凝集素购于美国Sigma公司；RT-PCR相关试剂及抗体购自美国Thermo公司；蛋白质印迹相关试剂及抗体购置于美国Cell Signaling公司和武汉博士德生物技术有限公司等；部分MTT溶液等按标准步骤配制而成。

二、动物模型制备

采用随机数字表法将大鼠分为实验组和对照组，每组20只，实验组采用胆总管结扎法建立大鼠HPS模型，而对照组仅开腹并分离胆总管，无其他处置。术前禁食8 h，4%水合氯醛1 mL/100 g腹腔内注射麻醉，固定操作台，沿腹白线开腹，于胃窦寻找十二指肠降段，找到并分离胆总管，用4-0线在胆总管末端双线结扎后关腹。术后分笼饲养，观察大鼠皮肤光泽色泽、排尿颜色、精神状态等，并检测动脉血氧分压及NO浓度来验证造模是否成功。腹部超声观察胆总管扩张情况。HPS模型大鼠处死，取出肝脏及肺脏组织10%甲醛固定，包埋蜡块并切片H-E染色，观察肝脏纤维化及假小叶形成情况，以及肺脏微血管扩张表现。

三、大鼠PMVEC分离与培养

组织块法培养原代PMVEC，在低糖DMEM培养基中加入肝素，采用植物凝集素BSI结合实验鉴定培养的细胞是否为PMVEC。

四、血浆相关指标检测

RT-PCR方法检测IL-6 mRNA表达，引物IL-6(509bp)：F-GAC TGA TGT TGT TGA CAG CCA CTG C;R-TAC CCA CTC CTT CTG TGA CTC TAA CT, 反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，33个循环72 ℃ 7 min，所用试剂盒为美国Thermo公司；ELISA法按照试剂盒说明书检测IL-6蛋白水平；MTT和流式细胞术分别检测PMVECs增殖和凋亡情况；蛋白质印迹方法测定pJAK和pSTAT的蛋白表达。

五、统计学处理

结 果

一、大鼠HPS动物模型建立成功

在胆总管结扎术后4～6周，动物肝硬化形成，部分并发HPS。术后3 d，大鼠精神萎靡，肤色及尿液变黄，一般状态差，动脉血气氧分压下降，血浆NO水平升高，2周后更加明显，4周后超声见胆总管扩张。4～6周将大鼠处死观察，胆总管明显扩张、肝脏表面见纤维条索瘢痕，病理示肝脏假小叶形成(图1)及肺微血管扩张(图2)，表明大鼠HPS建模成功。

图1 肝病理组织学变化 术后4周肝脏炎细胞浸润、结缔组织增生部分假小叶形成(H-E，400X)

图2 肺组织病理学变化 术后6周肺微血管扩张，并见少量红细胞位于肺泡腔

二、 IL-6在大鼠HPS模型中的表达水平

对比常用炎症细胞因子，如TNF-α、IL-8、IL-1和IL-6，通过实时定量PCR方法发现IL-6的mRNA水平明显高于对照组，P<0.05,差异有统计学意义；ELISA方法检测IL-6蛋白水平，结果表明其IL-6水平明显高于其它组。表明IL-6的表达水平在大鼠HPS模型中显著增加。

三、IL-6促进了PMVEC的增殖水平以及抑制了脂多糖所诱导的细胞凋亡

IL-6作用于体外分离培养的PMVEC，通过MTT方法检测其细胞增殖情况，结果显示，PMVECs在96孔板中以2 000个细胞每孔的密度培养1,3,5或7天，IL-6组和非IL-6组相比，IL-6促进了PMVEC增殖水平；我们对PMVEC进行脂多糖处理，并且加入或者不加入IL-6，以200 000个细胞每孔的密度培养12 h，然后通过流式细胞术的方法对细胞凋亡进行检测。结果显示IL-6对于脂多糖所诱导的PMVEC的凋亡现象具有明显的降低效应。

四、IL-6可以激活PMVEC的JAK2/STAT3信号通路

PMVECs进行IL-6处理，12 h后通过Western Blot的方法对JAK的磷酸化水平进行检测。PMVEC被IL-6处理12 h后，JAK2的磷酸化水平显著性地增加了，而同一时间，JAK1和JAK3的mRNA水平在这些实验组的PMVEC中却没有明显的变化。

五、JAK表达的下降抑制了PMVEC的增殖以及诱导了IL-6所激活的细胞凋亡

我们对PMVECs进行JAK2的敲除，然后通过MTT实验来检测细胞增殖水平。结果显示JAK2的mRNA水平被RNAi所显著性地敲除，而STAT3也是处于没有被激活的状态，当PMVEC被IL-6所处理后，下调表达的JAK2可以抑制细胞增殖的水平。通过流式细胞术的方法检测了细胞周期的水平，结果显示在JAK2被敲除后，G1/G0期的比例明显增加了，而S期以及G2/M期的水平显著性地降低了。同时我们对PMVEC进行STAT3的敲除。结果显示在对细胞进行STAT3的siRNA的转染后，PMVEC的STAT3处于没有被激活的状态。因而，我们的结果显示STAT3可以促进PMVEC的增殖，细胞周期的进程，以及抑制细胞凋亡。

讨 论

HPS病因不清，发病机制复杂，目前认为肺微血管扩张及低氧血症参与其发生过程。多数学者认为PMVECs增殖和新生血管的形成在HPS发病机制中作用明显[7]。其促发因素包括多种血管活性物质和细胞因子，如NO、CO、TNF-α等，近些年来IL-6的作用得到重视，其参与多种细胞病理生理活动，如细胞增殖、分化等。

HPS的研究多数基于动物实验，因此动物模型的成功建立尤为重要，目前普遍认为胆总管结扎术式建模成功率高[8]，我们的实验也证明了这一点。在HPS模型判断上我们的创新之处是在术前和术后分别给予大鼠行超声波检查，判断胆总管宽度，之后再行动脉血气分析和血浆NO水平测定，这样可更准确判断模型建立。

目前研究认为多种血管活性物质及细胞因子参与到了PMVECs的增殖及微血管扩张中，并促进了HPS的发生[9]。其中NO是目前公认的扩血管物质，通过PMVECs产生的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性增加，参与HPS的形成与发展[10]。而HPS形成时因肠黏膜屏障影响形成肠源性内毒素血症，内毒素可刺激炎症相关细胞因子的产生，如TNF-α、IL-1、IL-6等，促进NO产生并舒张肺血管[11]，从而引起HPS发生。本实验也证明了这一观点。我们通过实时定量PCR的方法在大鼠HPS模型中测定多种炎症细胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8，结果发现IL-6的mRNA水平较对照组明显升高，差异具有统计学意义。我们将PMVEC进行体外培养，采用ELISA方法检测IL-6的蛋白水平，结果得出与mRNA一致的现象，以上结果表明IL-6的表达水平在大鼠HPS模型中显著增加。

既往研究认为部分细胞因子参与PMVEC的增殖，促进了新生肺血管的形成，那么IL-6是否具有这些特征呢？笔者通过实验进一步研究了IL-6对PMVEC增殖的影响。体外分离培养了PMVEC，将IL-6作用于该细胞，采用MTT方法对细胞增殖进行检测，结果表明，IL-6促进了PMVEC的增殖；同时采用脂多糖诱导了PMVEC凋亡，通过两组(加IL-6组和不加IL-6组)对比研究，采用流式细胞术的方法进行细胞凋亡检测，结果表明IL-6对脂多糖诱导的PMVEC的凋亡现象具有明显的降低效应。因此，笔者认为IL-6具有促进PMVEC增殖并抑制细胞凋亡的作用。

众所周知，细胞因子是通过特定细胞传导通路而发挥调控作用，而目前国际上对于IL-6/JAK/STAT这一信号通路研究较多，在炎症、肿瘤、细胞增殖及凋亡中被广泛报道[12-14]。在细胞周期、细胞增殖领域中具有良好的研究基础，笔者的实验也进一步研究证明了IL-6对细胞增殖的影响是通过激活JAK2/STAT3信号转导通路实现的。我们对PMVEC进行IL-6的处理，12 h后通过Western Blot的方法对JAK的磷酸化水平进行检测。当PMVEC被IL-6处理12 h后，JAK2的磷酸化水平显著性地增加了，而同一时间，JAK1和JAK3的mRNA水平在这些实验组的肺脏微血管内皮细胞中却没有明显的变化。同时对PMVECs进行JAK2的敲除，然后通过MTT实验和流式细胞来检测细胞增殖及凋亡水平，结果表明STAT3可以促进PMVEC的增殖，细胞周期的进程，以及抑制细胞凋亡。研究证明，IL-6/JAK2/STAT3信号转导通路参与了PMVEC的增殖调控中，促进了HPS的形成。

综上所述，HPS发病机制复杂，对其基础研究经验主要来源于动物实验。HPS的胆总管结扎模型成功率高，但需注重几个细节。IL-6在HPS发生发展过程中起到重要作用，具有促进PMVEC增殖及抑制凋亡作用，其发生作用的关键信号转导通路为JAK2/STAT3途径。我们的发现为更好地认识HPS的病理机制提供了理论基础，但IL-6在HPS中研究较少，作用机制复杂，需要有更多的实验去论证与支持。