酵母菌厌氧发酵机制的教学探讨

2021-03-14李从虎

安庆师范大学学报(自然科学版) 2021年1期

李从虎，吴彦

（安庆师范大学生命科学学院，安徽安庆246133）

微生物发酵机理是指人类利用微生物的分解代谢与合成代谢活动，将基质合成人们所需要的产品的内在规律[1]，它是发酵工程教学的重点内容。然而，微生物发酵机理的知识涉及碳源代谢、氮源代谢、能量代谢以及复杂的代谢控制流系统，知识抽象、复杂，代谢控制理论很难理解和应用。因此，如何将该知识整合、优化，简明扼要地传授给学生是发酵工程教学的当务之急。

在众多微生物中，酵母菌具有安全性高、碳源利用率较高、代谢产物少和在酸性条件下易于生长繁殖的优良特性[2]。因此，酵母菌在食品、医药、生物能源和单细胞蛋白等领域得到广泛应用[3]。酵母菌的厌氧发酵机制是微生物发酵机理的重要内容之一，掌握该知识对于发酵机理知识的融会贯通具有重要的意义。然而，目前的教材编排主要以产品进行分类，这导致学生难以厘清酵母菌的发酵。如果以酵母菌为主旨，将其发酵机制进行有效串联，从广度、深度和学科性上都能促进学生对微生物发酵机理知识的掌握。

1 糖酵解（EMP）途径

EMP途径是葡萄糖分解代谢的基本途径之一，是酵母菌进行发酵生产的基本前提[4]。因此，了解和掌握EMP途径为学生掌握酵母菌的厌氧发酵机制奠定了理论基础。图1为EMP途径的简明示意图。

图1 糖酵解（EMP）途径简明示意图

EMP途径主要发生在微生物的细胞液中，大致分为两个阶段：第一阶段主要是耗能阶段，由1分子葡萄糖生成2分子3-P-甘油醛，消耗2分子的ATP；第二阶段是产能阶段，主要由3-P-甘油醛转化为丙酮酸的阶段，此阶段生成4分子的ATP。因此，1分子葡萄糖经EMP途径净生成2分子ATP。有氧条件下，丙酮酸进入三羧酸（TCA）循环彻底氧化分解为CO2和水，并生成大量ATP；无氧条件下，丙酮酸进一步被还原成乙醇、甘油、乙酸、乳酸等各种发酵产物，与发酵工业有密切的关系。

己糖激酶、磷酸果糖激酶（限速酶）和丙酮酸激酶是EMP途径的3个关键酶，控制着EMP途径能否有效进行。EMP途径的产能虽然较少，但是其关键酶的调节仍受到细胞内能量水平的控制。如表1所示，当细胞内产能反应增加时，ATP含量升高，磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性被抑制，导致EMP途径减少；反之，当细胞内耗能反应增加时，ATP被分解为ADP或者AMP，ADP和AMP激活己糖激酶和磷酸果糖激酶，导致6-P-葡萄糖、1,6-2P果糖和3-P-甘油醛的含量增加，这3种中间代谢物含量的增加又激活了丙酮酸激酶的活性，最终促进EMP途径的增加[1]。此外，6-P-葡萄糖、柠檬酸、NADH和丙氨酸亦分别是己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的抑制剂，使EMP减少。有报道称，酿酒酵母进行发酵时，可在1 min内将其细胞的能荷状态恢复到初始水平[5]。

表1 EMP途径调节信息

2 酵母菌的酒精发酵

酵母菌的酒精发酵如图2所示。在掌握了EMP途径后，我们不难发现酵母菌细胞中酒精的生成来源于EMP途径中的产物丙酮酸。在丙酮酸脱羧酶（焦磷酸硫胺素为辅酶，并需要Mg2+）的催化下，丙酮酸脱羧生成乙醛和CO2，随后在乙醇脱氢酶的作用下，乙醛作为受氢体被还原成乙醇。

图2 酵母菌的乙醇生成机制

因此，葡萄糖生成乙醇的总反应式为C6H12O6+2ADP+2H3PO4→2CH3CH2OH+2CO2↑+2ATP。根据此总反应式，1分子葡萄糖在酵母菌细胞内进行分解代谢时，可生成2分子乙醇、2分子CO2和2分子ATP。可见，酵母菌进行酒精发酵生产时，其产能也相对较低。由于葡萄糖和乙醇的相对分子质量分别为180.1和46.05，可计算出乙醇的理论转化率为[ ( 2×46.05 )/180.1]×100%=51.1%。

在实际生产过程中，由于5%左右的葡萄糖可以用于酵母菌自身组成成分和其他副产物的合成，因此乙醇对葡萄糖的实际转化率约为理论值的95%。酵母菌的乙醇发酵是酵母菌进行发酵的主体产物之一，其在酒类行业中得以广泛应用，在教学实际中应结合科技前沿予以补充。如郭燕等人从中高温大曲中分离出了性能优良的异常威克汉逊酵母Y1、东方假丝酵母Y2以及酿酒酵母Y3和Y4，经过产酒试验，发现4株酵母的产酒能力从高到低依次为Y3、Y4、Y1、Y2，该研究为提高小曲酒品质和开发大曲中的微生物资源提供了有效路径[6]。郑海武等人从酿酒葡萄产区分离得到4株酵母菌，其中WJ1和Q12产酒能力达（10%～11%）vol，与商业酵母菌产酒能力相当，此外还具有明显的嗜杀性、低泡性和高絮凝性等，符合国标要求，为本土酿酒酵母的多样性以及葡萄酒的生产研究提供了理论基础[7]。

3 酵母菌的甘油发酵

3.1 亚硫酸盐法

正常情况下，酵母菌在厌氧条件下代谢流的主体产物为乙醇，该过程相当彻底。如在进行酵母菌的甘油发酵生产时，加入NaHSO3，乙醛与NaHSO3发生加成反应生成难溶的乙醛加成物，致使乙醇脱氢酶的底物消失，最终导致乙醇无法合成。此时，酵母菌的代谢途径发生变化，由磷酸二羟丙酮作为氢受体，并在磷酸甘油脱氢酶的催化下生成磷酸甘油，磷酸甘油继续水解生成甘油，如图3所示。理论上，1分子葡萄糖可生成1分子甘油。然而，在甘油生产的整个代谢过程中并无ATP的积累，因此，酵母菌无法获得能量从而导致发酵终止，产物无法生成。为克服这种缺陷，可采取以下措施：（1）厌氧条件下，NaHSO3不能添加太多，保留一部分酒精发酵，以使酵母菌获得生命所需的能量；（2）有限供氧，使一部分糖代谢进入TCA循环，从而有利于酵母菌甘油发酵，然而由于TCA循环的存在会产生许多中间代谢物，使得甘油的提纯较麻烦。为提高酿酒酵母的甘油产量，康毅等人对酿酒酵母D254发酵甘油的条件进行了优化，发现当葡萄糖初始浓度为216 g/L、发酵温度32℃、pH为3.0时，发酵的甘油产量达0.66 mol/L[8]。因此，如果人为改变条件，控制代谢流的方向，可使产物的形成种类发生改变。这使学生认识到，对内在规律掌握后可熟练进行代谢控制发酵。

图3 酵母菌亚硫酸盐法甘油发酵示意图

3.2 碱法

酵母菌进行酒精发酵时，如果将发酵液的pH设置在7.6以上时，此时代谢流亦会发生改变。在碱性条件下，此时乙醛不能作为正常的受氢体，因此无法直接被还原成乙醇。然而，2分子乙醛之间可发生歧化反应，相互氧化还原，生成1分子乙醇和1分子乙酸。此外，在另外一条代谢流中，磷酸二羟丙酮作为受氢体，接受3-磷酸甘油醛脱下的氢，进而生成甘油，如图4所示。因此，2分子葡萄糖在碱法甘油发酵时，主要产物是2分子甘油、1分子乙醇和1分子乙酸[1]。该法与亚硫酸盐法相似，整个代谢过程并无ATP的积累，因此需采取一定的措施保障酵母菌自身的生命活动，并生产大量的甘油。

图4 酵母菌碱法甘油发酵示意图

4 其他副产物的生成

酵母菌进行酒精发酵时，除了主产物乙醇之外，还生成一些杂醇油、酸类、酯类等副产物，多达40余种，其生成机制如表2所示。这些副产物是构成白酒、黄酒、葡萄酒等酒类风味的重要组成物质，直接影响酒类产品的质量。陈玉香等人通过酵母菌发酵生产红曲黄酒，发现酵母菌可以代谢合成乙酸异戊酯、丁二酸二乙酯以及乙酸-2-苯乙酯等酯类和苯乙醇、庚醇和丁醇等醇类物质，有效提升黄酒的风味品质[9]。范光森等人从古井贡酒曲中分离出6株酵母菌，其在发酵时均可产生乙酸乙酯、异丁酸己酯、3-甲基-1-丁醇、乙酸、苯甲酸等风味成分，表明酵母菌在白酒酿造过程中可有效增强白酒的风味，提升白酒的品质[10]。