用于有机磷农药及其水解产物可视化检测的荧光探针制备及性质研究

王 彦，余 海，王利杰，袁欢欢，石道飞

（安庆师范大学化学化工学院，光电磁功能材料安徽省重点实验室，安徽安庆246133）

农药包括多种有机毒性化合物，对昆虫、细菌、野草、线虫等危害农作物的物种具有防御作用，被广泛应用于农业生产中。其中有机磷农药的使用最为广泛，这造成了有机磷农药在水资源、土壤以及农作物中的蓄积与残留，危害环境安全以及人体健康[1-5]。美国环境保护局对各种有机磷农药在环境和农产品中的残留量作了严格的规定，即最高残留限量（MRL）。农药的高毒性源于它可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，某些农药即使很小的剂量，也会对健康造成极大的危害。因此发展新型的、高灵敏的、经济的环境以及农作物中农药残留的传感技术对于保护人类健康以及环境安全具有重要的意义。毒死蜱（chlorpyrifos，CP）是一种广谱性有机磷杀虫剂，是目前世界应用广泛的杀虫剂之一。2013年农业部发出公告，对毒死蜱和三唑磷等7种农药采取进一步禁限用管理措施，控制其在蔬菜中的使用。因此，需设计针对毒死蜱的灵敏检测方法。

目前已有多种方法被用于农药的检测，例如气、液相色谱-质谱联用[5-8]，电化学分析[9]，酶联免疫吸附实验[10-13]等，但是这些方法存在操作繁琐、数据重复性差、设备不便携等缺点，无法满足实时在线检测的需求。贵金属纳米材料具有表面等离子激元共振效应，可以用于量子点多色光致发光、表面增强拉曼等领域的研究。将纳米材料的独特光学特性与荧光传感方法高灵敏度、高选择性的优势相结合，可以构筑一系列具有优越性能的荧光传感器，从而实现对不同分析物的实时、灵敏、可视化在线检测[14-20]。以贵金属纳米材料构筑传感器件的纳米探针，为有机磷农药残留分析提供了新的手段[21-22]。因此，本文报道基于金纳米颗粒的荧光探针的设计方法，以用于环境样品中农药残留的可视化检测。

1 实验部分

药品及仪器。实验用化学药品有氯金酸溶液、柠檬酸三钠、罗丹明B、二乙氧基硫代磷酰氯（阿拉丁试剂及药品），乙腈、氯仿、氢氧化钠和盐酸（国药集团化学试剂有限公司）。实验所用化学试剂均为分析纯，且未作任何处理，蒸馏水自制。测试仪器有HitachiF-4500型荧光分光光度计（日本日立公司）、透射电子显微镜（TEM）（日本电子公司）。

金纳米颗粒的制备。本实验首先采用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子。将50 mL氯金酸溶液（1 mM）移入装有回流冷凝管的圆底烧瓶中加热至沸腾，在强力搅拌下快速注入38.8 mM柠檬酸三钠5 mL，继续回流30 min。溶液颜色由浅黄色变成深红色，停止加热，继续搅拌冷却至室温。放到冰箱4℃保存、备用。

金纳米颗粒的修饰。利用超纯水制备2 mM的罗丹明B溶液。取10μL罗丹明B溶液搅拌加入10 mL浓度为15 nM的金纳米颗粒中。混合溶液在室温下搅拌两小时，反应完全后收集溶液，并测其荧光光谱。

毒死蜱碱性水解产物二乙氧基硫代磷酸的制备。在单口烧瓶中加入体积比为1.25∶1的乙腈和水，并在磁力搅拌下使其混合均匀。然后在混合液中加入2 mL的二乙氧基硫代磷酰氯和1.6 g氢氧化钠，摩尔比约为3∶1。在30°C的条件下搅拌12 h，然后利用盐酸将反应液调至弱酸性，并用氯仿萃取，收集有机相，旋蒸后得到产物。

2 结果与讨论

2.1 金纳米颗粒的透射电镜（TEM）表征

用透射电镜观察金纳米颗粒的形貌，其结果如图1所示。由图可见，金纳米颗粒是单分散的，平均粒径为13.3 nm。金纳米颗粒的浓度是通过监测520 nm的吸收（摩尔吸光系数为K=108 M-1·cm-1）来计算得到，利用朗伯比尔定律计算为15 nM。

图1 金纳米颗粒的透射电镜图

图2 金纳米颗粒吸收拟合曲线

2.2 检测体系的设计原理与信号响应

探针的设计基于两个必要条件：（1）罗丹明B与金纳米颗粒之间有荧光共振能量转移（FRET）的通道[23-24]，通过目标分子的加入以调节能量转移通道的开关；（2）农药分子与金纳米颗粒表面的非共价作用力强于罗丹明B，将罗丹明B分子从金纳米颗粒表面置换下来。探针的设计如图3所示。

图3 荧光增强型探针的识别原理

首先确定罗丹明B与金纳米颗粒之间可以发生FRET，由图4（a）中可以看出，金纳米颗粒在520 nm左右有明显的特征吸收，罗丹明B在580 nm左右有特征荧光发射峰，金纳米颗粒的吸收与罗丹明B的荧光发射存在一定程度的光谱重叠，满足荧光共振能量转移发生的条件。因此，当罗丹明B非共价吸附在金纳米颗粒表面时，由于能量转移，罗丹明B的荧光被淬灭。

由图4（b）可以看出，当没有加入DEP时，罗丹明B-金纳米颗粒（RhB-AuNPs）的荧光强度较低，当向探针中加入1μM的DEP时，体系的荧光强度明显增强两倍多，同时伴随着探针溶液荧光强度的可视化变化。在体系中没有DEP时，在365 nm紫外灯的激发下，探针溶液呈现十分微弱的橙色荧光，引入DEP到探针溶液中显示明亮的橙色荧光，从光谱图与照片中可以看出罗丹明B的特征荧光发射峰恢复。这是因为毒死蜱在碱性条件下可以发生水解反应生成硫代二乙氧基磷酸（diethylphosphorothioate，DEP）和三氯吡啶酚（3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP）［结构如图4（c）所示］，毒死蜱及其碱性水解产物硫代二乙氧基磷酸均含有磷硫键，磷硫键与金表面有很强的配位能力，强于罗丹明B在金表面的吸附能力，从而能够取代吸附在金表面的罗丹明B分子。由于发生配位取代后，罗丹明B从金纳米颗粒表面脱附，无法满足FRET发生的条件，从而使罗丹明B的荧光恢复。因此探针RhB-AuNPs可以灵敏地识别DEP。

图4 （a）金纳米颗粒的吸收谱、罗丹明B的发射光谱、RhB-AuNPs的荧光光谱；（b）加入1μM DEP前后RhB-AuNPs的荧光光谱及实物照片；（c）毒死蜱在碱性条件下水解生成硫代二乙氧基磷酸和三氯吡啶酚

2.3 荧光检测毒死蜱及其碱性水解产物

以上实验结果表明，DEP可以调节罗丹明B与金纳米颗粒之间的能量转移。图5显示CP与DEP均能使体系的荧光增强，相比之下，DEP使荧光增强的趋势更明显。当DEP加入到RhB-AuNPs体系中时，荧光强度逐渐增强，在低至0.1 nM的DEP浓度时，仍然能够检测到明显的荧光增强，说明探针对DEP有很好的灵敏度。当DEP的浓度达到1mM时，体系的荧光强度变化趋势平缓，相较于加入DEP之前，荧光强度增强了4倍左右，如图5（b）所示。荧光增强过程是非线性的，存在一个饱和的DEP浓度，表明吸附在金纳米颗粒表面的DEP与罗丹明B有一个动态平衡的过程。CP碱性水解形成的DEP不仅具有P=S键，还带有离域的S=P=O键，配位能力更强，因此取代作用更明显，引起的荧光强度变化更大，这和已报道的探针特性相吻合[25-27]。

图5 纳比探针RhB-AuNPs荧光强度的变化。（a）不同浓度的CP；（b）不同浓度的DEP

对荧光强度和底物浓度作Stern-Volmer曲线，如图6所示，发现其变化趋势明显向上弯曲，不是线性的，表明增强的过程是通过静态途径或静态、动态相结合的途径进行的，在这种情况下，应用非线性Stern-Volmer方程，I0/I=Aek[Q]+B，其中A、B和k是常数(Ksv=A×k)，根据公式DL=3σ/M（σ为标准差，M为斜率），CP的Ksv=5.24×105M-1，检出限为2.3×10-11M；而DEP的Ksv=1.031×106M-1，检出限为1.16×10-11M[27]。

图6 (I0/I)-1与CP浓度（a）、DEP浓度（b）和KSV的非线性Stern-Volmer图

3 结论

利用金属纳米颗粒和荧光分子的能量转移原理，本课题组设计了基于金纳米颗粒的荧光探针实验方案。实验中设计制备非共价修饰罗丹明B的金纳米颗粒，并从荧光共振能量转移的信号响应原理出发，结合罗丹明B与农药分子在金纳米颗粒表面的竞争吸附作用，发展了荧光增强型的灵敏检测农药残留的传感方法。当农药分子存在时，体系荧光强度呈现4倍左右的增强，并伴随由微弱荧光-强橙色荧光的灵敏可视化变化。该方法不需要为了实现FRET过程在纳米材料表面进行复杂繁琐的表面修饰过程，简单易行，在环境与农产品中有机磷农药残留的检测方面具有一定的应用前景。