没食子酸酶法聚合

丁若男，李楠楠，傅佳佳,2，苏静

(1.江南大学 江苏省功能纺织品工程技术研究中心，江苏 无锡 214122;2.江苏阳光集团，江苏 江阴 214426)

没食子酸是一种天然多酚[1]，又称作3,4,5-三羟基苯甲酸，因其抗氧化[2]、抗炎、抑制细胞活性[3]和抗癌活性[4]而被广泛应用。漆酶作为一种多酚的氧化还原酶[5]，它可引发底物形成自由基，自由基之间聚合生成有色聚合物[6]。酶染作用条件温和、环保，在生态染整方面具有一定的优势，也为纺织品生物染色提供思路[7]。

本文选用没食子酸单体作为漆酶作用的底物，催化合成低聚物或高分子化合物。基于漆酶催化酚类单体产生自由基进而聚合生成有色多聚物，并通过不同的测试方法，对聚合产物的结构和性能进行表征。因聚合产物显示有色，后续可能会用于纺织品的染色和功能整理[8-9]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

漆酶(Trameteshirsuta)，实验室自制；没食子酸(GA)、2，2-联氮二(3-乙基苯并噻唑)二胺盐(ABTS)、醋酸钠、醋酸、2，5-二羟基苯甲酸、KBr粉末、二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯。

CP114电子天平；移液枪;Thermo Mixer微型反应器；Synergy H1酶标仪；SK2510 HP超声水浴锅;Q500热重分析仪;Q200差示扫描量热仪;美国Labconco FreeZone 2.5 L台式冻干机；Microflex LT飞行时间质谱仪；Nicolet is10傅里叶变换红外光谱仪；Bruker AduanceⅢ全数字化核磁共振波谱仪。

1.2 酶活测试

称取ABTS固体(2.8 mg)溶解在去离子水(10 mL)中，通过检测在420 nm处ABTS+自由基所变化的吸光度值来确定漆酶酶活。首先，选用0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH=5.0)分别制得0.5 mmol/L的ABTS溶液和浓度适宜的待测酶溶液，然后从以上两种配制好的溶液中分别取用100 μL充分混合，迅速用酶标仪读取混合液吸光度值，其中参数设置：420 nm处每间隔1 min测试1次，总计10 min。1个漆酶活性单位(U)指的是：室温条件下在1 min内氧化能够得到1 μmol ABTS+自由基所需的酶的总量[10]。

1.3 聚合实验

称取(10 mg/mL)没食子酸单体适量，将其溶解于10 mL醋酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L，pH=5)中，完全溶解后，加入漆酶(300 μL，100 U/mL)、羊毛织物(5 cm × 5 cm)，在40 ℃的微型反应器中以300 r/min振荡，引发聚合反应。反应过程中确保反应液与空气充分接触。反应24 h后，取出织物，水洗后置于烘箱中40 ℃烘干。剩余反应溶液需离心、过滤，再将剩余液体经冻干机冷冻干燥处理，最后获得聚合产物粉末，保存备用。

1.4 表征测试

1.4.1 紫外-可见分光光谱分析 利用酶标仪对聚合反应过程中不同反应时间的反应溶液进行紫外-可见吸收光谱扫描，绘制出不同时刻反应液在230～700 nm吸光度的变化曲线。

1.4.2 FTIR红外-吸收光谱 称取适量待测样品与198 mg KBr粉末混合，研磨时间1～2 min，然后压片。利用傅里叶变换红外光谱仪对没食子酸单体及其反应获得的聚合产物分别进行测试。其中参数包括扫描范围4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1，次数32次。

1.4.3 核磁共振氢谱分析 将没食子酸单体及其聚合产物两个测试样品均以20 mg/mL的浓度溶解于DMSO溶剂并置于核磁管中标记，然后利用核磁共振波谱仪对每个样品进行1H NMR测试，内标为四甲基硅烷(TMS)。

1.4.4 MALDI-TOF飞行时间质谱分析 将1 mg没食子酸及其聚合反应产物分别溶解在0.2 mL TA30或者0.1%TFA中，取1 μL溶解后溶液与1 μL基质混合，取1 μL混合液点到样品靶上，空气中自然晾干，再利用飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)在正离子反射模式下对样品进行测试。

1.4.5 游离酚羟基含量测定 使用Folin-Ciocalteu[11]分光光度法测定聚合前后的游离OH基团总量。将溶解在DMSO(100 μL)中的单体和聚合产物溶液添加到Folin-Ciocalteu试剂(500 μL)和蒸馏水(6 mL)的混合物中，并将混合物振摇1 min。之后，将Na2CO3溶液(15%，2 mL)加入到混合溶液中摇动1 min。通过添加蒸馏水将溶液补足至10 mL。2 h 后，在750 nm(25 ℃)下测量吸光度。

1.4.6 热重分析 称量5 mg待测试样品放入铝制坩埚中，利用热重分析仪，设置其升温速度10 ℃/min，由25 ℃升至600 ℃，整个测试将置于流速为60 mL/min的N2环境中。

1.4.7 差示扫描测试分析 称取5 mg的待测样品，将其放入DSC固体坩埚中，利用差示扫描量热仪将法兰温度降至-80 ℃，进行测试。设置其升温速率为10 ℃/min，从40 ℃升温至400 ℃，于流速为50 mL/min的N2氛围中进行测试。

1.4.8 聚合产物粒径测定 将聚合产物溶解于合适的介质中，在环境温度下利用Zetasizer nano ZS分析仪对反应所得产物胶束的平均粒径大小及多分散指数进行测试，并观察粒径的分布状况。

2 结果与分析

2.1 紫外-吸收光谱

由图1可知，没食子酸单体溶解在醋酸盐缓冲溶液中呈无色透明状，在260 nm紫外区由于苯环振动存在π→π＊电子跃迁，可见光区没有吸收峰。随着时间的变化，反应24 h的反应液在380 nm左右出现了新的吸收峰，B带红移，但是漆酶的加入并没有对反应液紫外区吸收光谱产生影响，这也说明没食子酸单体间的聚合对苯环结构没有影响[8]，但是反应过后产物的共轭体系变大，从而产生了有色聚合产物。

图1 反应24 h后反应液的紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectrum of the reaction solution after 24 h of reaction

2.2 红外光谱分析

对没食子酸单体和没食子酸聚合物的FTIR分析结果见图2。

图2 没食子酸单体及其聚合产物红外吸收光谱图Fig.2 Infrared absorption spectrum of gallic acid monomer and its polymerization products

由图2可知，没食子酸和没食子酸聚合产物的红外吸收光谱存在明显差异。没食子酸单体在3 498,3 287 cm-1存在明显的羟基(—OH)伸缩振动吸收峰，但聚合产物中该波段的峰明显减少，说明没食子酸单体在漆酶催化作用下发生了氧化，部分酚羟基被氧化失去了氢原子。没食子酸单体在1 607，1 539，1 428 cm-1处是苯环结构的伸缩振动吸收峰，同聚合产物对比可得，聚合产物在1 600～1 200 cm-1苯环的骨架振动吸收峰发生了明显变化，由此也表明没食子酸单体发生了氧化聚合反应。1 189，1 132 cm-1为C—C伸缩振动吸收峰，可推测聚合产物中各重复单元是以碳链的形式连接的。单体曲线中865，734 cm-1分别是苯环上的相邻氢，从框选部分可以看到，聚合物图谱中已经不存在，说明苯环上的部分氢参与了聚合反应。

2.3 核磁共振氢谱分析

核磁结果表明,与没食子酸单体相比，聚合产物的羟基含量明显降低，即没食子酸在漆酶催化氧化作用过程中，酚羟基被氧化(见图3)。化学位移δ10.5～13是—COOH的化学信号，在聚合过程中，由于空气中含有氧气，通过漆酶4个铜离子协同催化作用，与空气中的氧气接触催化底物氧化和对氧气的还原；δ8～9是苯环上氢键的信号，但是单体和聚合产物相比可以看出，聚合产物在δ8.85，δ9.28处的信号消失，说明苯环上部分氢被取代，显示出较弱信号或无信号；δ6.5～8是苯环上酚羟基的氢的电化学信号，同上发生取代，为了进一步测定，通过Folin-Ciocalteau方法对聚合物中游离酚羟基的含量进行了检测。结果见图4，将没食子酸底物的酚羟基含量作为标准，发现漆酶催化后所得聚合产物溶液中游离酚羟基含量显著减少，从而进一步说明没食子酸酶法聚合过程中酚羟基参与到氧化聚合反应，与核磁中酚羟基化学信号减弱结果相符合。

图3 1H NMR图谱没食子酸(A)，聚没食子酸(B)Fig.3 1H NMR spectrum gallic acid(A),polygallic acid(B)

图4 游离羟基含量测定Fig.4 Determination of free phenolic hydroxyl groups

2.4 飞行时间质谱分析

通过MALDI-TOF 测试聚合物的分子量大小及其分布，不同聚合度聚合物分子量见表1。

表1 聚合产物MALDI-TOF测定相对分子量Table 1 Relative molecular weights of MALDI-TOF

没食子酸酶法聚合所得产物的分子量大小主要分布于300～1 500 Da，这些是代表了不同聚合程度的没食子酸的寡聚物(即从二聚体到八聚体)，主要峰的间距为182 Da，182表示失去两个羟基并携带两个Na+。412 Da是没食子酸二聚体，其中两个单体的对羟基、羧基上的氢均被Na+取代[12]；质荷比594，777，959，1 142，1 318，1 500附近的质谱峰分别对应的是没食子酸的三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体和八聚体，呈现规律性变化，表明聚合反应形成低聚物的多样性。推测在自由基聚合的整个过程中，没食子酸分子间反应消耗了两个酚羟基，且对位酚羟基和羧基均被取代，从而致使相邻质谱峰间的质荷比差了182 Da，MALDI-TOF MS检测为正离子反射模式，聚没食子酸分子缓冲溶剂中钠离子(Na+)加和，因此对应没食子酸中的重复单元[C7H2O3]n2Na+。

2.5 热性能分析

见图5(A)，没食子酸TG曲线显示在0～224 ℃，没食子酸质量基本保持恒定，当温度升到256 ℃时质量损失率达到最高，约33.26%，结合DSC曲线在264 ℃出现明显吸热峰，可知，没食子酸的分解温度为264 ℃左右[13]，当温度升至348 ℃时其损失率已经明显超过50%，温度升至600 ℃时质量损失率甚至达到73%；由图5(B)可知，聚没食子酸的DSC曲线显示，在100 ℃之前可能是聚合产物中残余试剂挥发导致失重，结合TG曲线可知，当温度升至358 ℃时，聚没食子酸失重速率明显减缓，可能是聚合产物中低聚物先发生分解，随着温度的继续升高，聚合度高的聚合物开始缓慢分解，最终温度升至600 ℃时，质量损失率才达到56%，此外，聚没食子酸的分解峰稍高于没食子酸的分解峰，由此可以推出聚合产物具有较好的热稳定性。

图5 没食子酸(A)和聚没食子酸(B)的DSC和TG曲线Fig.5 DSC and TG curves of gallic acid(A) and polygallic acid(B)

2.6 粒径大小分析

通过Zeta电位仪可对聚合物溶液中粒子的大小及分布情况进行了测试及分析。不同浓度的聚合产物粒径测试结果分析如下：

漆酶催化所获得的聚合产物以不同浓度溶解在水溶液中，粒径均分布在200～300 nm范围。低浓度聚合产物较高浓度聚合产物显示出较小的粒径，但分散均匀稳定性有一定程度下降。因此，可以看出，对于同种聚合产物以不同浓度存在时，浓度较大的分散体系就会表现出粒径尺寸较大，相反浓度小的分散体系则呈现较小的粒径尺寸，分散均匀性也有所变化[14]，后续会根据应用要求来选用合适溶解浓度。

表2 不同浓度聚合产物的粒径分析Table 2 Particle size analysis of polymerproducts at different concentrations

3 结论

漆酶催化没食子酸聚合，得到有色聚合产物，通过UV-Vis、红外、核磁共振氢谱、飞行时间质谱对没食子酸酶法聚合产物的结构进行测试、表征和分析，最终发现聚合产物其实是不同聚合程度的没食子酸寡聚物(即从二聚体至八聚体)，从而推测出聚合产物可能的结构单元，但是具体的结构式需进一步研究说明。其热性能表征结果可以看出聚没食子酸具有较好的热稳定性，因而可推测该聚合产物在酶染和功能改性中具有较好的应用前景。漆酶催化多酚类单体生成聚合物，这是一种比较新颖、先进的聚合物合成方法，但是由于漆酶存在重复利用率低、成本高等缺点，研究后续会考虑利用高能反应器来提高漆酶的利用率，以达到更好的应用效果，并且会对聚合物功能特性进行进一步研究，拓展其使用领域。