韩城大红袍花椒组织培养快速繁殖体系的建立

张红娜 王卫平 解晶晶 姚 静 雷瑞芳 卫 婷 张 妍

（韩城市花椒研究所，陕西 韩城 715400）

韩城花椒是调味佳品和保健良药，主要用于干制以及深加工,全市有花椒加工企业30多家，先后研发出7类35个花椒系列产品，获得相关专利100多项，建有全国唯一的国家花椒产业园区和多个花椒专业贸易市场，拥有一支2000多人的花椒专业销售队伍，在北京、重庆、四川等地设有花椒直销网点100多个。产品出口东南亚及欧美等地。 但当前花椒生产仍存在一些突出的问题, 如 :品种杂乱、良种化程度低、良种选育进程缓慢。因此，韩城市花椒研究所通过3年花椒组织快繁试验，总结出一套可行的组培快繁育苗体系。

1.实验材料

本次实验所用的材料为韩城市花椒研究所花椒科技服务中心种质资源圃的韩城大红袍花椒1年生的植株。

2.研究方法

2.1 外植体的选择

选取韩城大红袍花椒的顶芽和腋芽。

2.2 外植体的消毒处理

取生长健壮的顶芽和腋芽，将表面的杂物清理干净，在流动的自来水下冲洗30min，然后将冲洗过的材料置于无菌的广口瓶中，用体积比75%的酒精表面灭菌30s后，用2%～5%的次氯酸钠灭菌1min～3min，再用培养瓶中的无菌水依次浸泡冲洗3次，每次摇晃1min以上，最后置于灭菌过的滤纸沥干，将基部切削后接种在培养基内。

将以上灭菌好的外植体材料，接种在WPM的基本培养基上，在20天以后统计污染率，30天以后统计死亡率。

污染率=（污染个数/外植体个数）×100%

死亡率=（死亡个数/外植体个数）×100%

2.3 培养条件

在实验中，基本培养基使用MS和WPM，在不同的培养阶段使用不同浓度的蔗糖和激素，凝固剂使用琼脂，强度为1400g/cm2,使用量为5.2g/L,pH值为5.8-6.0，培养室温度为25℃±2℃，培养室相对湿度为50%±10%，光照强度为2400lux～2700lux,光照时间为14h/d,培养基灭菌消毒的物理指标为120℃～122℃，0.11MPa～0.13MPa持续25min。

2.4 初代培养

2.4.1 不同基本培养基对诱导不定芽的影响

取韩城大红袍花椒处理成活的外植体接种在分裂素为1.0mg/L的6-BA和0.2mg/L的GA3的激素培养基中,选用不同的基本培养基进行筛选，每组培养基接种20株外植体（每瓶接种1株外植体），重复3次，30天后统计出外植体的出芽率。

不定芽的出芽率=（长出不定芽的个数/外植体个数）×100%

表2 不同基本培养基

2.4.2 不同激素及浓度对诱导不定芽的影响

取韩城大红袍花椒处理成活的外植体接种在基本培养基WPM中,选用不同的植物生长调节剂6-BA、NAA在不同的浓度上进行筛选，每组培养基接种20个外植体（每瓶接种1个外植体），重复3次，30天后统计出外植体的出芽率。

表3 外植体处理的激素水平

B3 WPM 30 0．6 0．2 0 5．2 6．0 B4 WPM 30 0．8 0．2 0 5．2 6．0 B5 WPM 30 1．0 0．2 0 5．2 6．0 B6 WPM 30 1．2 0．2 0 5．2 6．0 B7 WPM 30 1．4 0．2 0 5．2 6．0 B8 WPM 30 1．6 0．2 0 5．2 6．0 B9 WPM 30 1．8 0．2 0 5．2 6．0 B10 WPM 30 2．0 0．2 0 5．2 6．0 C1 WPM 30 1．0 0．2 0．1 5．2 6．0 C2 WPM 30 1．0 0．2 0．2 5．2 6．0 C3 WPM 30 1．0 0．2 0．3 5．2 6．0 C4 WPM 30 1．0 0．2 0．4 5．2 6．0 C5 WPM 30 1．0 0．2 0．5 5．2 6．0

2.5 增殖培养

经过外植体诱导培养形成不定芽，再后期主要的是将不定芽进行繁殖获得大量瓶苗，将诱导的不定芽作为培养材料筛选出最佳增殖培养基。

2.5.1 不同激素及浓度对不定芽增殖的影响

将诱导的不定芽接种在基本培养基为WPM,选用植物生长调节剂NAA0.1mg/L和6-BA的不同浓度，每种培养基接种20瓶，每瓶接种5株不定芽，重复3次，45天后统计出不定芽的增殖系数。

不定芽的增殖系数=长出不定芽的个数/接种不定芽的个数

表4 不定芽增殖培养不同激素水平

2.6 壮苗生根培养

当不定芽增殖到一定的数量，在驯化炼苗之前需要进行瓶苗的壮苗生根阶段，将增殖的不定芽作为培养材料筛选出最佳的壮苗生根培养基。

2.6.1 不同基本培养对壮苗生根培养的影响

取增殖不定芽接种在生长素为1.0mg/L的IAA和生长调节剂0.01mg/L的NAA的激素培养基中,选用不同的基本培养基上进行筛选，每瓶接种10个不定芽，重复3次，30天后统计出生根率。

生根率=长出根的个数/接种的个数×100%

表5 壮苗生根培养不同基本培养基

2.6.2 不同植物生长调节剂使用不同的浓度对壮苗生根培养的影响

取增殖不定芽接种在基本培养基为1/2MS,选用不同的植物生长调节剂IBA和NAA在不同的浓度上进行筛选，每种培养基接种20瓶，每瓶接种10个不定芽，重复3次，30天后统计出不定芽的生根率。

生根率=长出根的个数/接种的个数×100%

表6 壮苗生根培养不同的激素水平

3.结果与分析

3.1 外植体的消毒处理

分别对韩城大红袍花椒的顶芽和腋芽使用75%的酒精30s后，再按表1所示的消毒处理方法进行操作。

表1 次氯酸钠不同的浓度不同的消毒时间

由表7数据分析可知，从取材部位的选择上，腋芽的综合成功率要略高于顶芽；从次氯酸钠的使用浓度对比上，选用2% 的次氯酸钠处理外植体均出现污染现象，选用2% 的次氯酸钠相比选用4%和5%两个次氯酸钠的浓度处理外植体成功率最低，选用4%次氯酸钠浓度相比较选用5%次氯酸钠浓度处理腋芽成功率略高；从外植体处理时间上分析，数据参差不齐，综合分析，使用4%的次氯酸钠浓度处理腋芽2分钟成功率最高。

表7 韩城大红袍花椒不同的取材部位和次氯酸钠不同的浓度不同的消毒时间对外植体的影响

3.2 不同基本培养基对诱导不定芽的影响

由表8数据分析可知，选用基本培养基为WPM，蔗糖浓度为30g/L,琼脂5.2g/L的基本培养基对外植体诱导不定芽最佳。

表8 不同基本培养基对韩城大红袍花椒外植体诱导不定芽的影响

3.3 不同激素及浓度对诱导不定芽的影响

由表9数据分析可知，6-BA在0.2mg/L至1.6mg/L的范围内，随着6-BA使用浓度的提升，不定芽的诱导率逐渐上升，6-BA在1.6mg/L至2.0mg/L的范围内，随着6-BA使用浓度的提升，不定芽的诱导率逐渐下降，出现愈伤组织较多，NAA在0.1mg/L至0.5mg/L的范围内，随着NAA使用浓度的提升，不定芽的诱导率逐渐下降，出现愈伤组织较多，综合分析所得当选用6-BA1.6mg/L和NAA0.1mg/L对外植体诱导不定芽最佳。

表9 不同激素水平对韩城大红袍花椒外植体诱导不定芽的影响

3.4 不同激素及浓度对不定芽增殖的影响

由表10数据分析可知，当选用6-BA1.0mg/L对不定芽的增殖培养的扩繁数量最多。

表10 不同激素水平对韩城大红袍花椒不定芽增殖的影响

3.5 不同基本培养对壮苗生根培养的影响

由表11数据分析可知，当选用1/2MS为基本培养基对壮苗生根培养最佳。

表11 不同基本培养基对韩城大红袍花椒壮苗生根培养的影响

3.6 不同激素浓度水平对壮苗生根培养的影响

由表12数据分析可知，IAA在0.2mg/L至1.0mg/L的范围内，随着IAA使用浓度的提升，生根率逐渐上升，IAA在1.0mg/L至2.0mg/L的范围内，随着IAA使用浓度的提升，生根率逐渐下降，NAA在0.01mg/L至0.05mg/L的范围内，随着NAA使用浓度的提升，生根率逐渐下降，综合分析所得当选用IAA1.0mg/L和NAA0.01mg/L对壮苗生根最佳。

表12 不同的激素水平对韩城大红袍花椒壮苗生根培养的影响

4.结论

4.1 在韩城大红袍花椒外植体的取材部位选择上以春季萌发的腋芽最优。

4.2 在外植体的消毒处理的方法中，“将腋芽表面杂物物理清理干净→流动的自来水下冲洗30min→体积比75%的酒精表面灭菌30s→4%的次氯酸钠灭菌2min→无菌水依次浸泡冲洗3次，每次摇晃1min以上”的处理外植体的方法成功率最高。

4.3 在外植体诱导不定芽的培养过程中以WPM+6-BA1.6mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.2g/L+pH6.0作为培养基最佳。

4.4 在不定芽的增殖培养过程中以WPM+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.2g/L+pH5.8作为培养基最佳。

4.5 在生根壮苗的培养过程中1/2MS+IAA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.2g/L+pH5.8作为培养基最佳。