低温木质纤维素分解复合菌系PLC-8对玉米秸秆的分解特性

杨梦雅, 闫非凡, 闫美超, 王贺, 朴仁哲, 崔宗均, 赵洪颜*

(1.延边大学农学院， 吉林 延吉 133002； 2.中国农业大学农学与生物技术学院， 北京 100191)

我国是农业大国，秸秆年产量11.13亿 t，秸秆的综合利用对于社会可持续发展具有重要意义[1]，尤其在我国北方粮食主产区，秸秆资源非常丰富，受低温影响秸秆降解率是一直困扰秸秆还田化和肥料化处理方式的现实问题。秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，由于天然木质纤维素的结构非常复杂，因此如何快速分解木质纤维素一直是秸秆资源生物转化和利用的瓶颈。研究证实，单菌的木质纤维降解能力要远远低于多菌协同的复合菌系，因此利用复合菌系降解木质纤维素的研究越来越受到重视[2-4]。目前，分离了多种具有分解秸秆的纤维素分解菌复合系，但主要集中在高温和中温复合菌系对秸秆降解率方面的研究。崔宗均等[5]在60 ℃下成功构建了高效而稳定的复合菌系MC1，培养4 d水稻秸秆的分解率可达60%[6]，培养15 d分解小麦秸秆70%[7]；王伟东等[8]在高温堆肥材料中筛选得到了复合菌系WSC-6，培养3 d水稻秸秆的分解率可达82.2%；Eichorst等[9]从高温堆肥材料中富集得到高温好氧复合菌系，分析了复合菌系的多样性。王小娟等[10]筛选出菌群WSD-5，在30 ℃下培养15 d小麦秸秆分解率为75.6%；王伟东等[11]筛选出复合菌系BYND-8，在30 ℃下培养12 d水稻秸秆分解率为64.98%；究其原因是高温和中温复合菌系菌群的多样性更丰富，可解除产物的反馈抑制，调节培养液的pH，提高了菌株之间的协同作用，从而可提高纤维素的转化率，因此，复合菌系表现出较强的分解能力。萨如拉等[12]利用继代培养和低温驯化的方法，在低温15 ℃条件下筛选到了2个复合菌系，玉米秸秆的降解率仅在30%左右。低温下木质纤维素复合菌系报道相对较少，主要原因是低温下，复合菌系菌群多样性低、稳定性较差、降解效率低，因此报道较少。

本研究采用限制性培养驯化手段获得低温复合菌系PLC-8，通过pH、木质纤维素含量、玉米秸秆减重、挥发性有机酸含量、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和高通量测序技术研究玉米秸秆的分解效果和微生物群落动态，为东北寒区秸秆还田和肥料化利用的快速降解提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

低温木质纤维素复合菌系PLC-8由本实验室从低温生态环境腐叶土中筛选获得。

改良察氏培养基：1.0 g·L-1K2HPO4，1.0 g·L-1(NH4)2SO4，1.0 g·L-1NaNO3，0.5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.01 g·L-1FeSO4·7H2O，0.5 g·L-1KCl，pH 7.0～7.5，所用试剂均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

玉米秸秆预处理方法：将玉米秸秆剪成7 cm的小段，用1.5%的NaOH溶液浸泡24 h后，然后用自来水冲洗秸秆冲洗并浸泡24 h，至pH为7.0左右，105 ℃烘干至恒重后备用。

1.2 培养条件

装有64 mL改良察氏培养基的100 mL三角瓶内，将0.8 g经预处理的玉米秸秆作为碳源，在121 ℃下灭菌15 min后备用。将培养到第40代的PLC-8复合菌系按照总体积的20%接种到新鲜培养基中，20 ℃下静置培养。

1.3 复合菌系分解玉米秸秆过程中评价指标测定

1.3.1pH测定 取培养液5 mL，用pH计(SX-620，上海右一仪器有限公司)测定。

1.3.2秸秆重量及半纤维素、纤维素和木质素含量测定 将滤纸60 ℃烘干至恒重，记录滤纸重。将培养液同分解玉米秸秆残渣用滤纸过滤，过滤玉米秸秆残渣连同滤纸60 ℃烘干至恒重，去除滤纸重后得到分解玉米秸秆残渣重。将玉米秸秆粉碎，过1 mm筛，称取0.5 g，装入专用滤袋中。用纤维分析仪(ANKOM 200i，美国安卡姆科技公司)测定纤维素、半纤维素、木质素含量。具体步骤参考马旭光等[13]方法。

1.3.3纤维素酶和木聚糖酶活性测定 酶活包括滤纸酶、内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶酶活。以滤纸50 mg、2%羧甲基纤维素钠、2%微晶纤维素、0.5%的水杨苷、1%的燕麦木聚糖为底物，使用5.59 g·L-1磷酸氢二钾和0.41 g·L-1磷酸二氢钾混合配制缓冲液。采用IUPAC推荐的方法测定滤纸酶、内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶酶活，待反应结束后利用紫外可见光分光光度计 (UV-7502PC，上海垒固仪器有限公司)在波长540 nm处测定吸光值[14]。

1.3.4有机酸含量测定 取1.5 mL待测样品于2 mL的离心管中，12 000 r·min-1离心10 min，取0.75 mL上清液，并与等量的乙腈混匀，12 000 r·min-1离心10 min，离心后取上清液使用有机滤膜(直径13 mm，孔0.22 μm)进行过滤。利用高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)进行测量，色谱柱采用HITACHI LaChrom C18-AQ(5 μm)，柱温25 ℃，波长210 nm，流动相由1 mmol·L-1H2SO4和8 mmol·L-1NaSO4混合配制，流速0.2 mL·min-1，进样量10 μL·次-1，采集时间45 min。采用甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸为标样，绘制标准曲线，对待测样品的出峰物进行定性分析。

1.4 16S和26S rRNA PCR-DGGE分析菌群变化

利用北京百泰克生物科技公司淤泥基因组DNA快速提取和真菌基因组DNA提取试剂盒提取每个处理样品的总DNA，采用细菌通用引物对357F-GC和517R[15]扩增16S rRNA的V3区[16]，采用真菌特异引物NL1-GC和LS2[17]扩增26S rRNA的D1区[17]。引物序列如表1所示，由上海生工公司合成。PCR扩增仪器为S1000TM Thermal Cycle， 美国Bio-RAD公司。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

PCR产物用DGGE分析仪 (DCodeTM Universal Mutation Detection System ，美国Bio-Rad公司)进行分析[15,18-19]。从胶上回收条带，经扩增、浓缩后进行碱基序列分析，所用引物和反应条件同上。将PCR产物送上海生工测序，基于GenBank数据库对碱基序列进行比对，分析相似性。

1.5 复合菌系微生物组成的鉴定

PLC-8培养15 d进行采样，将样品送至上海美吉生物医药科技有限公司完成Miseq高通量测序。对测序数据经拼接、质控、去接头之后获得优化序列，基于优化序列将其97%相似性聚类成为OTUs(operational taxonomic units)。对每条序列进行物种分类注释。统计每个样品在各分类水平上的构成，利用柱状图对物种分类信息可视化。

2 结果与分析

2.1 复合菌系分解玉米秸秆过程中pH变化

从图1可以看出，在第5 d时，培养液的pH降到最低，从起始的7.2降至平均6.94，主要是由于复合菌系分解木质纤维素的过程中产生有机酸。之后开始逐渐回升，在5～10 d内上升速度较快，随后pH变化变缓，第30 d时，pH平均达到7.55，原因在于复合菌系中多种微生物协同作用，其产物互相利用和中和，形成较为稳定的生态循环系统。pH整体呈现一个先下降后回升至微碱性的趋势，表明复合菌系具有良好的pH调节能力。

2.2 复合菌系分解玉米秸秆过程中秸秆重量变化

培养液中玉米秸秆重量的变化趋势如图2所示，在0～5 d时，玉米秸秆重量减少速度相对较快，平均降低了17.35%；第5～20 d重量减少的速度减慢；第20～25 d内重量减少的速度增加；第25～30 d重量减少的速度开始变缓。可以看出，在pH降低时，玉米秸秆重量减少速度加快；pH回升时，玉米秸秆减重速度相对较缓。

2.3 复合菌系分解玉米秸秆过程中半纤维素、纤维素和木质素分解率变化

测定不同时间的培养液中的玉米秸秆中的半纤维素、纤维素、木质素含量，结果如图3所示。可以看出，半纤维和纤维素在0～5 d内降解速度相对较快，半纤维素下降了35%，纤维素下降了12%，在第30 d时，半纤维降解了57.28%，纤维素降解了40.9%。木质素含量在整个过程中的绝对含量下降，在0～5 d，玉米秸秆的重量迅速减少，纤维素和半纤维素较快分解，木质素的含量也处于上升阶段。

2.4 复合菌系分解玉米秸秆过程中纤维素酶和木聚糖酶活性变化

如图4所示，复合菌系分解过程中产生的滤纸酶即总纤维素酶活性在第20 d达到了最高峰0.054 U·mL-1，随后滤纸酶活性缓慢下降，在第30 d该复合菌系的滤纸酶活性下降到其最高峰值的87%。复合菌系分解木质纤维素过程中，纤维素内切酶和外切酶均在第15 d达到最高峰，分别为0.032和0.030 U·mL-1，到第30 d，分别下降到最高值的93%和92%。β-葡萄糖苷酶在第20 d达到最高峰，为0.032 U·mL-1，到第30 d，下降到最高值的93%。

在复合菌系分解过程中木聚糖酶活性如图5所示。随着木质纤维素分解，木聚糖酶却继续增长，可能是由于玉米秸秆半纤维素的主要成分是木聚糖，随着半纤维素的持续分解，产酶的活性也随着增加。

2.5 复合菌系分解玉米秸秆过程中挥发性有机酸含量变化

对5种挥发性有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)进行检测，甲酸和乙酸的浓度发生变化。从表2可以看出，甲酸的高峰值出现在第20 d，只有0.101 3 g·L-1，此后处于下降趋势。随着发酵的进行，木质纤维素降解，在5～10 d，有机甲酸的积累量增加速度相对较快。乙酸的浓度远大于甲酸，在15 d达到最高值2.423 5 g·L-1，这是由于pH在这个阶段增加速度减慢，此后乙酸逐渐减少。乙酸的浓度减少的原因可能与复合菌系中存在以乙酸为代谢底物的微生物有关。上述结果表明，随着接种复合菌系发酵产物中甲酸和乙酸的积累，可能是造成pH开始下降的主要原因。并且这两种有机酸在发酵后15～20 d最高。

表2 复合菌系分解玉米秸秆过程中挥发性有机酸含量变化 Table 2 Changes of volatile organic acids content during the decomposition of corn stover by microbial consortium

2.6 复合菌系分解玉米秸秆过程中细菌和真菌的变化

在筛选过程中定期对各代的培养基进行保存，提取其DNA利用PCR-DGGE分析菌种的动态变化。发现该复合菌系从41代开始复合菌系传代变化稳定。

由图6可知，在分解过程中培养中的细菌和真菌群落DGGE条带分析结果在分解木质纤维素过程中，细菌和真菌的主体变化不是很大，其中真菌相对较于细菌而言主体变化更加明显，可能是因为真菌在该复合菌系中占较大的作用。其中条带A、B、C、D、E、a、c、d、e、f、g在所测培养液中均有存在，但是分解过程中的条带亮度差异明显，其中条带C、F和g的亮度较大；条带b在第25 d有出现，其他时间均未出现。

由图7、8可知，该复合菌系中有许多未培养的细菌，其中条带g与Hypocreales(MH876163.1)有相对较高的相似性。

2.7 复合菌系细菌与真菌组成多样性分析

在第15 d时，内切酶和外切酶活性达到最高峰，根据PCR-DGGE结果(图6)可以看出，此时菌群相对其他时间变化微弱，在第15 d后，玉米秸秆的纤维素、半纤维素、木质素的降解率速度开始变慢，因此对第15 d进行高通量测序。

由表3可知，JY中细菌一共有32 745条有效序列，JY中真菌一共有39 227条有效序列。按97%相似性聚类分析，JY中细菌有82个OTUs，真菌有4个OTUs。

表3 JY中细菌、真菌组成丰度和多样性指数Table 3 Richness and diversity index of bacterial, fungus community for JY

样品JY细菌在门的分类水平上对相对丰度统计结果为:变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)。由图9可知，JY样品中细菌在属水平上相对丰度高于1%的共有14个，其中相对丰度较高的、占优势的菌属为金黄杆菌属(Chryseobacterium，16.27%)；短波单胞菌属(Brevundimonas，14.56%)；不动杆菌属(Acinetobacter，13.11%)；无色杆菌属(Achromobacter，9.24%)；鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium，8.62%)；固氮螺菌属(Azospirillum，7.44%)；副球菌属(Paracoccus，6.38%)。细菌群落的多样性在分解木质纤维素中起着重要的作用，有助于维持生物降解过程中的稳定性。

样品JY真菌在门的分类水平上对相对丰度统计结果为担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、Cryptomonadales。JY样品在真菌组成在属的水平上包含4个属的真菌，JY中相对量较高的占优势菌属为肉座菌(Hypocreales，95.63%)、毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon，3.97%)。

3 讨论

目前,对于低温下分解木质纤维素的研究相对较少，而我国东北地区冬季漫长，同时玉米秸秆资源量大，尤其吉林省占全国玉米秸秆10%以上[20]，基于农业生产实际在低温区玉米秸秆的还田化和肥料化利用可以发挥秸秆的营养元素回归土地，提供土壤的有机质，但是玉米秸秆的降解率一直是难点。低温下复合菌系的开发可以充分提高秸秆的降解率，本研究筛选的PLC-8在20 ℃下培养30 d，玉米秸秆的降解率达到43.65%，比前人研究的高温、中温菌的降解率相对较低，但是该低温复合菌系能够实现低温区玉米秸秆快速降解回馈农田的目标，尤其是低温复合菌系与高温、中温相比较具有一定的区域应用优势性。

该复合菌系实现可限制性人工长期驯化功能较强、结构稳定的菌群，抵御外界的干扰能力比纯培养微生物强等优势。此外，PLC-8是细菌和真菌共同存在复合菌系，大多数报道的中高温复合菌系是由细菌组成[5,8,11]，有很少数中温复合菌系是由细菌和真菌组成[21]，细菌和真菌共存增加了菌群之间代谢产物的协同作用，因此在低温下具有较强木质纤维分解效果。有学者从长白山土壤中分离出耐低温纤维素酶高产真菌菌株，但是单一菌株产酶单一[22]，PLC-8同时产生滤纸酶、内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶以及木聚糖酶，这与复合菌系PLC-8中存在真菌和细菌有很大的关系，至于它们之间的代谢关系如何，需要更近一步的研究。

利用低温菌剂降解秸秆进行还田，能够加快秸秆的腐熟、增加土壤微生物数量、提高农作物产量。赵伟等[23]研究了低温菌剂降解东北黑土区秸秆还田，发现使用菌剂能增加土地微生物多样性及碳、氮含量，且施用低温菌剂的处理在提高土壤微生物方面优于常温菌剂。常洪艳等[24]通过模拟秸秆还田的培养试验发现施用低温菌剂可以明显提高玉米秸秆降解率、改善土壤的理化性质和酶活性；利用低温菌剂堆肥化处理秸秆，张书敏等[25]利用低温复合菌系接入到玉米秸秆和牛粪混合堆肥中，发现低温复合菌系能够使堆肥升温速度加快，缩短堆肥周期，加快堆肥腐熟。陆水凤等[26]在玉米秸秆简易堆肥中添加低温菌剂，发现添加菌剂可以缩短腐熟时间，增加了腐熟的效果。所以本研究的低温降解玉米秸秆复合菌系为寒区秸秆还田化和堆肥化利用快速分解菌剂提供保障。