高效液相色谱法测定食品中苏丹红的方法优化

◎ 陈伟洁，陆溶艳，聂 丹，莫志斌

（梧州海关，广西 梧州 543002）

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用水为超纯水。辣椒粉、辣椒酱、辣椒油和腊肠样品，均购自当地超市。

100 μg·mL-1苏丹红Ⅰ标准溶液、100 μg·mL-1苏丹红Ⅱ标准溶液、100 μg·mL-1苏丹红Ⅲ标准溶液，20 μg·mL-1苏丹红Ⅳ标准溶液，均购于农业农村部环境保护科研监测所。甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷，均为色谱纯，购自Fisher Chemical 公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A 型高效液相色谱仪（岛津公司），配SPD-M20A 型光电二极管阵列检测器和LCsolution 工作站；SB25-120 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TDL-40B 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；I-8-UV 型超纯水机（赛多利斯）；EFAA-AC-02型氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；涡旋仪；ME204 型电子天平（梅特勒-托利多）；苏丹红专用固相萃取柱（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.3 标准溶液的制备

准确移取苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品各1 mL，准确移取苏丹红Ⅳ标准品5.0 mL，用乙腈定容至10 mL，配成浓度10 μg·mL-1的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液。

1.4 高效液相色谱工作条件

采 用SHIMADZA VP-ODS 色 谱 柱（4.6 mm×250 mm，4.6 μm），柱温为35 ℃；进样量为20 μL；流动相为乙腈∶水（95%∶5%）；流速为1 mL·min-1；波长为500 nm。

1.5 样品前处理

1.5.1 辣椒粉

称取1 g 样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 正己烷，超声5 min，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液至平底蒸发瓶中，重复加入10 mL 正己烷超声离心至洗出液为无色，合并上清液，氮吹浓缩至5 mL 以下，待过柱净化。

1.5.2 辣椒油称取0.5 g 油样，加入3 mL 正己烷涡旋混合震荡溶解10 s，待过柱净化。

1.5.3 辣椒酱

称取1 g 样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 正己烷，涡旋2 min，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液至平底蒸发瓶中，用重复加入10 mL 正己烷涡旋提取至洗出液为无色，合并上清液，氮吹浓缩至5 mL 以下，待过柱净化。

1.5.4 腊肠

称取1 g 粉碎样品于50 mL 离心管中，加入10 mL正己烷涡旋混合振荡5 min，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液至平底蒸发瓶中，重复加入10 mL 正己烷涡旋提取至洗出液为无色，合并上清液，氮吹浓缩至5 mL以下，待过柱净化。

1.5.5 SPE 操作过程

依次用5 mL 二氯甲烷，5 mL 正己烷活化柱子；将待净化样液转移到柱子中，再用2 mL 正己烷润洗样品瓶，润洗液一并转移至柱子中；用5 mL 正己烷淋洗柱子，用5 mL 二氯甲烷洗脱并收集，将收集液在40 ℃下氮吹近干，用1 mL 乙腈定容，超声1 min，再涡旋混合10 s，过0.45 μm 有机滤膜，待上机分析。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

分别取苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液于180 ～800 nm 波长范围内进行扫描，结果表明苏丹红Ⅰ在波长478 nm 处有最大吸收峰，苏丹红Ⅱ在波长485 nm 处有最大吸收峰，苏红Ⅲ在波长506 nm 处有最大吸收峰，苏丹红Ⅳ在波长510 nm 处有最大吸收峰，进行综合考虑，选择500 nm 作为试验的检测波长[4]。

2.2 标准曲线与检出限

将苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液用乙腈依次稀释成0.1 μg·mL-1，0.2 μg·mL-1，0.4 μg·mL-1，0.8 μg·mL-1，1.6 μg·mL-1和2.4 μg·mL-1的混合标准溶液系列，在仪器工作条件下测定，以苏丹红质量浓度为横坐标，其对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性范围为0.1 ～2.4 μg·mL-1，线性回归方程和相关系数见表1。以3 倍信噪比计算方法的检出限（3S/N），结果见表1。

表1 苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的线性回归方程、相关系数和检出限表

2.3 精密度试验

按照仪器工作条件，对0.8 μg·mL-1的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合标准溶液进行6 次重复测定，以测定值的相对标准偏差（RSD）计算方法精密度，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的RSD分别为1.7%、2.3%、2.6%、1.9%，具体结果见表2。

2.4 回收试验

取有代表性的4 种阴性食品类样品，按照《实验室质量控制规范食品理化检测》（GB 27404—2008）标 准 规 定，分 别 添 加0.4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、1.6 μg·mL-1浓度水平的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液，每个浓度水平进样3 次，取平均值计算回收率，用于验证方法的准确性，试验结果见表3。

由表3 可知，4 种食品的回收率为87.5%～98.1%。

2.5 重现性试验

以辣椒粉为基底，添加0.4 μg·mL-1的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合标准溶液，按照试验方法进行测定，连续重复进样6 次，计算测定值的RSD，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的RSD分别为2.4%、1.5%、2.0%和2.2%，说明该方法具有良好的重现性，见表4。

表2 精密度试验结果表

表3 回收率试验结果表

表4 以辣椒粉为基底的重现性试验结果表

3 结论

本试验对高效液相色谱法检测苏丹红的方法进行了优化，优化后的方法采用乙腈和水按95%∶5%的比例洗脱，大大缩短了出峰时间，且峰型良好；用SPE 小柱代替国标中自制的中性氧化铝小柱，缩短了前处理时间，净化效果显著且回收率有所提高；优化后的方法具有灵敏度高、精密度好，重现性高和易于操作的优点[5]，适用于食品中苏丹红含量的日常检测。