探究PCR 技术在食品微生物检测中的应用

◎ 张丽敏，刘印欢，左丽娜，高 腾

（石家庄君乐宝乳业有限公司，河北 石家庄 050000）

1 食品微生物检测现状

有害微生物是导致食品风险的主要因素。微生物的种类有非常多，并且存在超强的变异性，微生物检测手段也一直在进步。随着近几年分子生物学的快速发展，具备超强特异性、灵敏度等优点的聚合酶链式反应（PCR 技术），已经成为食品有害微生物检测的一种常规方法。目前，很多生物制品公司利用传统的微生物检测原理设计了不同的检测仪器，同时，微生物检测应当向着快速、自动化方向发展，PCR 已经作为一种新的检测方法在一些行业和地区得到了应用。与传统的检测方法相比，PCR 技术检验速度快、特异性强、灵敏度高，可以减少对微生物培养的依赖，因此也逐渐成为食品检验中的常用方法。

2 PCR 技术

PCR 技术，全称聚合酶链式反应，是通过对温度的控制，从而在体外扩增出大量靶DNA 片段，该技术可将靶DNA 片段在短时间内扩增到十万甚至是百万倍。PCR 技术具备超强的特异性，它的原理是和DNA 的自然复制过程类似。通过温度的变化控制DNA 的变性、复性，完成DNA 体外复制。PCR 体外复制过程主要包含以下3 个步骤，①变性。温度在一定时间内保持在94 ℃左右，双链DNA 会解离成单链。②复性。将温度降低，保持在55 ℃左右，引物与单链DNA 结合。③延伸。通过TaqDNA 聚合酶的作用，将dNTP 作为反应原材料，合成和模板DNA 互补的一条新链。然后重复循环以上步骤，1 h 内即可完成大量DNA 的合成。一般情况下，PCR 技术的检验速度比传统模式更有优势。

3 应用PCR 进行检测的微生物菌种类型

3.1 沙门氏菌

沙门氏菌是一类主要寄生在人和动物肠道中的微生物，属于革兰氏阴性杆菌，其生化反应和人体的抗原结构有关。受污染的水是沙门氏菌感染的主要来源。沙门氏菌会导致人类和动物疾病，人类疾病的主要包括伤寒和败血症。沙门氏菌SP-1 的毒性很低，但是在菌体裂解过程中产生的强毒性的内毒素，会迅速侵入宿主细胞，从而危害人体健康。目前，invA、invb、hila、FIMA、16S rRNA 是沙门氏菌检测的主要靶基因。

3.2 单核增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌生长的温度范围为2～42 ℃，主要存在于污水和腐烂蔬菜中。它很容易通过食品和粪便传播。这种微生物是一种细胞内寄生细菌。单核细胞增生性李斯特菌感染早期常表现为非典型感冒样症状，临床表现为败血症、脑炎等，也可能导致流产。单核细胞增生李斯特菌的毒力基因主要包括LIPI-1 和UPI-2，最常用的检测基因是hly-A、inl-A 和ACT-A。

3.3 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是嗜盐菌，3.5%的NaCl 最合适微生物生长。副溶血性弧菌致病性的关键在于它与宿主细胞会产生相互作用。例如，TDH 的微生物可以使人或兔子的红细胞产生神奈川现象。但是这些基因在环境中很少被检测到。

3.4 阪崎氏肠杆菌

阪崎肠杆菌培养要求低，不形成孢子。这种微生物和单核增生李斯特菌相类似，其主要危害是引发人体脑膜炎和败血症。这两种病症的易感人群为早产儿和低出生体重儿这类抵抗力很弱的新生儿群体，因此其对新生儿的健康威胁还是很大的。阪崎肠杆菌感染不常发生，但婴儿感染所带来的风险是致命的，主要是附着在肠道组织上，通过血脑屏障导致婴儿脑细胞死亡。阪崎肠杆菌的分子检测主要是用ITS 基因和16S rRNA 两种基因进行测定。

3.5 金黄色葡萄球菌

目前没有针对金黄色葡萄球菌的疫苗。金黄色葡萄球菌营养要求不高，空气、水、灰尘和人畜排泄物都中可能存在。临床上重要的毒力基因包括luks/f-pv基因和TST 基因。

4 PCR 检测中的微生物采样

微生物采样需要做好有效的执行方法，确定了采样方案之后，采样方法的有效执行和样品的有效性在一定程度上与最后的检验结果有关。

4.1 现场采样注意事项

现场采样过程需要规范操作，所有的采样工具都应该是经过高压灭菌的，以避免一切污染，容器需要干燥清洁、大小合适，采样过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化，确保检样的代表性。若取样的是固体食品，也需要根据相关的管理办法，不破坏产品的代表性。若取样的是液体，应当在取样之前摇晃或者搅拌，将其混合均匀，通常情况下需要将样品冷却到0 ～4 ℃，再进行检验。

4.2 生产过程取样注意事项

生产过程中的取样中，应当注意其随机性和无菌性，以车间的用水取样为例，要从各个水龙头上取样，若进行车间卫生监测，应当在保证水龙头表面干燥的基础上，用无菌稀释液润湿棉签擦拭龙头表面，若检测空气状况，则在车间的四角和中部分别放置平皿盖，暴露采样检验。

5 PCR 技术在食品微生物检验中的应用

以牛奶样品的基因组提取与检验分析为例进行分析，操作步骤应当符合《分子克隆实验指南》。

5.1 DNA 提取

脂肪的密度较小，自然情况下会出现轻微的上浮，为了提升检验效率，一般会采用高速离心的方式实现脱脂。取乳品样品10 mL，将样品放置到LB 液体培养基中，充分混合，使用机器高速离心，时间设置为5 min，然后去除上层的脂肪。然后放入115 ℃的环境中高温灭菌，将微生物全部杀死，避免出现分裂影响实验结果的问题。在制备的样品中加入2 μL 蛋白酶，去除蛋白质，取10 μL 0.5 mol·L-1的EDTANa2溶液加入样品中，以上流程完成之后，应离心2 min 最后用灭菌生理盐水清洗。

5.2 测序

对分离株和产物的序列结果进行分析，以Gen Bank 公布的序列结果进行比照，分析其微生物的保守区序列和测序结果是否一致。

5.3 PCR 检测效果

用相同的引物和反应条件在无乳链球菌、沙门氏菌、无乳链球菌等DNA 中扩增，如果得不到已知的DNA 扩增片段，则证明了PCR 检验的单一性。牛奶样品的宏基因组的测定，主要进行普通PCR 和qPCR 两项检测。以沙门氏菌为例，如果未添加细菌的牛奶加标样品在连续梯度稀释下产生明显的扩增曲线，最后将样品放置在置有缓冲蛋白胨水中，在37 ℃的环境下培养，培养结果表明，部分沙门氏菌污染样品能被有效检测。

6 食品微生物检测结果判定标准

经PCR 检测得出单位食品样品中的微生物含量情况后，需要分析检测结果数据，并判定食品样品是否合格，判断方法主要有以下2 种。

6.1 二级法

二级法是根据样品数量（n）、不合格品储粮（c）、国家规定的合格判定标准（m）进行判断，超过m值即为不合格品。例如生海产品，n=5，c=0，m=102，n=5，即取5 个样品，c=0 表示该批样品中未发现超过m值的样品，则说明该产品合格。

6.2 三级法

二级法是根据样品数量（n）、不合格品储粮（c）、国家规定的合格判定标准（m）与判定为合格的菌数限量（M）进行判断，m、M这两个量是相互关联的，如果m不符合标准则直接不合格，如果m符合标准但是M不符合标准，则也是不合格。这一标准更加严格，以某批产品为例，n=5，c=3，m=101，M=102，这其中可以有小于等于3 个样品的菌种数量在m～M，如果有3 个以上的菌种在m～M，或者其中有任何一个超过M值，就说明这批产品不合格。

7 结语

总而言之，随着时代的发展，食品安全问题应当得到有效解决，高效精准的食品检验技术在当下具有很强的研究意义，而保证食品中微生物的检验的科学性、安全性，具有深刻的研究价值，为了达到提升食品安全质量标准的目的，应当做好微生物检测的深度研究，保证食品检验工作质量，保障大众的身体健康。