基于网络药理学研究黄芪-白术治疗新冠肺炎的作用机制

涂文玲，朱景茹，李墨辞，陈梅妹，杨朝阳，甘慧娟*

（1.福建中医药大学中医证研究基地，福建 福州350122；2.福建省2011中医健康管理协同创新中心，福建 福州350122；3.福建省中医健康状态辨识重点实验室，福建 福州350122）

爆发于2019年的新型冠状病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，NCP，下称“新冠肺炎”）属于急性呼吸道传染病，传染性强，部分感染者症状不明显或者无症状，但是变化速度快。国家卫健委将新冠肺炎纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施［1］。自《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》开始将中医药治疗纳入治疗方案，中医药全程参与了NCP的防治，发挥着重要作用，彰显了中医药的优势［2］。有研究发现，新冠肺炎患者淋巴细胞和白细胞计数减少，免疫功能下降是发病重要原因之一［3］。中医认为免疫力即是“正气”，正因为体内正气（免疫力）虚弱才会导致发病，因此应从益气补肺、扶正固本来进行治疗。董竞成教授团队近日发布新冠肺炎治疗方中用黄芪-白术以顾护正气［4］。黄芪甘微温，归肺、脾经，具有补气升阳、益卫固表等功效；白术甘苦温，归脾、胃经，具有健脾益气、固表止汗等功效。两者与防风同用，可益气固表，祛邪止汗，治疗虚人外感。在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》和《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》中，黄芪-白术被应用于恢复期肺脾气虚型NCP患者，且在北京、江西、湖北、浙江等省推出的NPC预防方案中常被使用［5］。马丽娟等［6］基于数据挖掘和关联规则分析得出黄芪-白术是治疗新冠肺炎的高频药对。现代药理表明黄芪-白术在机体中均能不同程度地改善免疫力和机体免疫反应性［7］，但是其作用机制仍不完整，因此有必要采用网络药理学的方法进一步探讨黄芪-白术治疗新冠肺炎的作用机制。

1 方 法

1.1 黄芪-白术有效活性成分收集与筛选 采用中药系统药理学平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］，在“herbname”检索框中分别以“黄芪”“白术”为检索词进行检索，收集黄芪、白术的活性成分信息。以口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）为筛选依据，筛选出黄芪-白术的活性成分信息。

1.2 黄芪-白术作用靶点信息获取 采用TCMSP数据库对筛选出的黄芪-白术的活性成分进行蛋白靶标获取，然后利用UniProt数据库中UniProtKB检索功能对蛋白靶标进行逐一检索，并在检索结果中将物种限定为“human”，对蛋白靶标进行一一对应的基因名称转换，获取黄芪-白术有效活性成分的作用靶点。

1.3 新冠肺炎作用靶点获取 以“novel coronavirus pneumonia”为检索词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）进行检索，获取新冠肺 炎 作用靶点。利用Venny2.1.0在线工具，获得黄芪-白术与新冠肺炎共同作用靶点，即是黄芪-白术治疗新冠肺炎的作用靶点。

1.4 网络的构建与分析 把黄芪-白术的单味药有效活性成分信息和有效活性成分-作用靶点信息导入Cytoscape软件（版本：3.7.2），绘制出单味药有效活性成分网络和有效活性成分-作用靶点网络，再选择“Merge”功能将两者合并成黄芪-白术的有效活性成分-作用靶点网络。将共同作用靶点导入到String数据库（https：//string-db.org/）“Multipleproteins”检索框中，蛋白种类设置为“homosapiens”，其他参数为默认设置，构建黄芪-白术与新冠肺炎共同作用靶点之间的相互作用网络（PPI网络），并对PPI网络进行分析。

1.5 GO和KEGG富集分析 对共同作用靶点进行GO和KEGG富集分析。先下载R软件，在R软件中进行下载并安装Bioconductor网站中的相关插件，包含“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”5个插件；安装完成后用R软件进行GO和KEGG富集分析。

2 结 果

2.1 黄芪-白术作用靶点 通过TCMSP数据库收集、筛选（OB≥30%、DL≥0.18）出黄芪-白术活性成分27个，其中黄芪20个、白术7个。剔除未找到蛋白靶标的活性成分，获得19个有效活性成分（其中白术与黄芪有一个相同的活性成分），其中黄芪16个、白术4个，见表1。筛选出的有效活性成分包含槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、蛇床子素（hederagenin）、毛蕊异黄酮（calycosin）等。对所有获取的蛋白靶标进行基因名转换后，去除重复项，共获得189个作用靶点。将筛选、转化后的单味药、有效活性成分及作用靶点导入Cytoscape软件（3.7.2版本）构建黄芪-白术有效活性成分-作用靶点网络，见图1。该网络包含210个节点，其中圆形节点为单味药，共2个；菱形节点为有效活性成分，共19个；六边形节点为作用靶点，共189个。

表1 黄芪-白术有效活性成分

2.2 黄芪-白术治疗新冠肺炎的作用靶点 通过GeneCards数据库检索得到新冠肺炎作用靶点259个，将黄芪-白术的作用靶点和新冠肺炎的作用靶点分别输入Venny2.1.0在线工具分析，得到共同作用靶点41个，包括前列腺素-内过氧化物合酶2（PTGS2）、二肽基肽酶4（DPP4）、一氧化氮合酶2（NOS2）、前列腺素-内过氧化物合酶1（PTGS1）、钙调蛋白1（CALM1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、丝裂原激活的蛋白激酶14（MAPK14）、RELA原癌基因（RELA）、白细胞介素-4（IL-4）、BCL2细胞凋亡调节剂（BCL2）、凋亡调节剂（BAX）、半胱天冬酶3（CASP3）、丝裂原激活的蛋白激酶8（MAPK8）、信号转导和转录激活子1（STAT1）、血红素加氧酶1（HMOX1）、细胞间黏附分子1（ICAM1）、表皮生长因子受体（EGFR）、BCL2凋亡调节剂（BCL2L1）、Fos原癌基因（FOS）、丝裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）、RB转录核心加压因子1（RB1）、白细胞介素-6（IL-6）、半胱天冬酶8（CASP8）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、蛋白激酶CAlpha（PRKCA）、热休克蛋白家族A（Hsp70）成员5（HSPA5）、白细胞介素-1β（IL-1β）、CCMotif趋化因子配体2（CCL2）、蛋白激酶CBeta（PRKCB）、一氧化氮合酶3（NOS3）、热休克蛋白家族B（HSPB1）、白细胞介素-2（IL-2）、丝氨酸（SERPINE1）、白细胞介素-1A（IL-1A）、聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）、CXC主题趋化因子配体11（CXCL11）、CXC基序趋化因子配体2（CXCL2）、C反应蛋白（CRP）、CXC基序趋化因子配体10（CXCL10）、CD40配体（CD40LG）、干扰素调节因子1（IRF1）。

图1 黄芪-白术有效活性成分-作用靶点网络图

2.3 PPI网络构建与分析 将41个共同作用靶点输入到String数据库，构建出这41个共同作用靶点的相互作用网络模型，见图2。该网络包含41个节点（即共同作用靶点），430条节点连接线（连接线表示两个节点之间存在相互作用，粗细代表相互作用关系的强弱）。该网络平均度值为21（度值指某一个节点与其他节点的连接数，度值越大，连接的节点数越多），其中IL-6、MAPK8、CASP3、MAPK1、CCL2、ICAM1、IL-1B、IL-4、MAPK14、PTGS2、RELA、FOS、EGFR、IL-2、CASP8、HMOX1、BCL2L1、NOS2、PPARG、STAT1、CXCL10和NOS3的度值高于平均度值，即为相对核心靶点。

图2 共同作用靶点互作（PPI）网络图

2.4 GO富集分析 通过R软件进行GO生物学过程富集分析，获得P＜0.05的GO条目84个，结果表明黄芪-白术治疗新冠肺炎过程主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、磷酸酶结合等生物学过程，做出前二十名GO富集气泡图，见图3。越红代表富集程度越高，P值越小。

2.5 KEGG富集分析 通过R软件进行KEGG信号通路富集分析，根据P＜0.05筛选到151条信号通路，涉及到的信号通路类型主要有病毒感染（人类免疫缺陷病毒1感染、eb病毒感染等）、癌症（小细胞肺癌、肝细胞癌等）、信号传导（IL-17信号、TNF信号、MAPK信号、P53信号、HIF-1信号、VEGF信号、B细胞和T细胞信号等）等，见表2。

3 讨 论

通过对黄芪-白术活性成分、作用靶点查找与筛选，得到19个有效活性成分，包含槲皮素、山奈酚、蛇床子素、毛蕊异黄酮等。槲皮素具有抗氧化、抗炎、增强免疫等作用［9-10］，能明显增加淋巴细胞转化率和T淋巴细胞数目［11］；山奈酚具有抗氧化、抗炎、调节免疫等多种生物学功能［12-13］，能有效抑制MAPK通路降低白介素8等炎症因子产生，且能明显提高T淋巴细胞的增殖能力，抑制胸腺细胞凋亡与巨噬细胞吞噬［14］；蛇床子素长期应用于皮肤瘙痒、湿疹等皮肤类疾病，愈来愈多研究表明蛇床子素具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、抗癌等生物学功能［15-16］，彭建明等研究表明蛇床子素能有效促进激活肺癌细胞H1299中促凋亡因子Bax来抑制NF-kB信号通路，诱导肺癌细胞凋亡［17］；毛蕊异黄酮是一种具有抗氧化、抗炎、抗癌和免疫调节功能的单体活性成分［18-20］。由此可见，黄芪-白术治疗新冠肺炎是通过这些活性成分起到抗炎、抗氧化及调节免疫的作用。

图3 前二十名GO富集分析气泡图

表2 KEGG富集分析结果（基因数排名前十）

通过对PPI网路分析得出22个相对核心靶点。白介素中的IL-6、IL-1β、IL-4、IL-2是调控范围最为广泛的细胞因子，在免疫系统中发挥着重要作用［21］，其中IL-6可以诱导B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体，也可以促进T淋巴细胞的增殖和激活从而参与机体的抗感染免疫和自身免疫。IL-1B是典型的促炎性细胞因子，炎性信号可通过激活炎症小体而刺激分泌IL-1B，少量的IL-1B可产生适当的炎症应答从而激活特异性免疫反应，起到免疫监视作用［22］，IL-4具有抗炎效应，可与具有促炎效应的细胞因子发生拮抗作用，对于巨噬细胞、T细胞等免疫细胞具有较大影响［23］。IL-2可促进细胞和体液免疫应答，对机体清除细胞内感染的病原体有积极的作用［24］，另外有研究显示：相对核心靶点中的CCL2对T、B淋巴细胞具有强大的趋化活性，从而调节机体自身免疫［25］和CASP3在凋亡、抗炎过程中起到重要作用［26］。

通过GO富集分析可知，黄芪-白术对新冠肺炎的治疗作用主要通过参与以下生物学过程而发挥疗效：细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、磷酸酶结合等生物学过程。进一步的KEGG富集分析提示黄芪-白术主要通过调控IL-17、P53、HIF-1、B细胞、T细胞等多种信号通路而达到治疗新冠肺炎的作用。研究表明：IL-17是致炎性细胞因子，与许多炎症性疾病和癌症的易感性相关［27］，在抗感染、炎症与自身免疫病的发生中起重要作用［28］；P53信号通路能够对肺结核进行免疫调控作用［29］；HIF-1参与缺氧代偿反应、免疫反应、新生血管的生成与调节等［30］，与系统性红斑狼疮等自身免疫疾病密切相关；B细胞主要代表体液免疫，由造血干细胞发育而来［31］，主要产生抗体；T细胞是一类控制体内免疫反应性细胞群，在维持机体免疫系统、调节免疫方面具有重要作用［32］。

综合有效活性成分、靶点基因、GO和KEGG富集分析，可表明黄芪-白术主要是通过抗炎、抗氧化及调节免疫作用以达到治疗新冠肺炎的目的。