补肾健脾方对卵巢早衰大鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能的影响

朱景茹，陈姝婷，卓泽伟，张 斐，王维斌，王 洋*

（1.福建中医药大学中医证研究基地，福建 福州350122；2.福建省中医健康状态辨识重点实验室，福建 福州350122）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）为多种因素导致的40岁之前女性卵巢储备能力降低的常见妇科内分泌疾病，以高促卵泡激素和低雌二醇激素水平为主要特征。POF的发病率逐年上升，约占成年女性的1%～3%，闭经患者甚至达到2%～10%，是目前女性生育力下降甚至丧失的主要原因之一。本病患者自然妊娠率低于15%，严重影响POF患者生殖健康［1-2］。现代医学采用激素替代疗法来保护剩余卵巢功能，建立人工周期，然而长期使用激素会大大增加罹患妇科肿瘤、静脉栓塞性疾病等风险，且发病风险性与服药剂量及疗程呈正相关［3］。随着近年来对POF的深入研究表明，中医药在整体观指导下进行辨证论治，能够有效改善卵巢卵泡发育情况，对POF患者有很好的防治作用。国医大师夏桂成和朱南孙一致认为脾肾虚弱、天癸亏耗是POF发病的主要病机，多采用补肾健脾法进行治疗，临床疗效突出［4-5］。有报道指出：补肾健脾类中药能够改善卵巢血液供应，促进各级卵泡生长发育，恢复卵巢储备功能，存在类雌激素样调节作用［6］。因此，本研究拟观察补肾健脾方对POF大鼠卵巢组织形态、内分泌水平等方面的影响，探讨补肾健脾方治疗POF大鼠的可能分子机制，为中医临床诊疗提供一定科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物2月龄SPF级雌性SD大鼠，体质量（180±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证编号：SCXK（沪）2017-0005，合格证号：20170005005273］。大鼠分笼饲养于福建中医药大学实验动物中心，每笼5只，控制室温20～22℃，相对湿度50%，自然光暗周期，普通饲料喂养，自由饮水，适应性喂养7 d，称取体质量后开始实验。整个实验过程对动物的处置遵循2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试剂和仪器 环磷酰胺（南京建成生物工程研究所，批号：X22D8Y51136）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20190228）；大鼠促卵泡素（FSH）、雌二醇（E2）、促性腺激素释放激素（GnRH）、抗苗勒管激素（AMH）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：20190506A、20190603A、20190605A）；RNA抽提试剂（北京索莱宝科技有限公司，批号：20190507）；Trizol（美国Thermo公司，批号：204210）；RNA反转录试剂盒、iTaq Univer SYBR Green SMX 500（美国Bio-Rad公司，批号：1708891、1725121）；丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的引物序列由福州市鼓楼区鼎国生物技术有限公司合成；QuantsStudio 6型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；Nanodrop 2000型微量紫外分光光度计（美国Thermo公司）；Rayto RT-6100酶标分析仪（雷杜生命科学股份有限公司）；Axio Imager A2型正置荧光显微镜（德国Carl Zeiss公司）。

1.3 药物制备 补肾健脾方为左归饮（《景岳全书》）与四君子汤（《太平惠民和剂局方》）合方，处方：熟地黄9 g，人参9 g，白术9 g，茯苓13.5 g，山药6 g，枸杞子6 g，山茱萸6 g，炙甘草9 g。中药饮片由福建中医药大学附属第三人民医院中药房提供，每周常规煎煮后浓缩至含生药量0.709 g/mL，3层干净纱布过滤3遍后用EP管分装，冻存于-20℃冰箱。

2 实验方法

2.1 模型建立与评价 将具有正常动情周期的34只大鼠按随机数字表法分为正常组10只，造模组24只。正常组不予处理，造模组大鼠腹腔注射环磷酰胺，首剂量50 mg/（kg·d），再以8 mg/（kg·d）连续注射14 d，建立POF大鼠模型［7］。从造模第7天起行阴道脱落细胞涂片，连续2个周期观察造模组大鼠动情周期变化。造模组大鼠动情期延长，甚至持续处于动情期，涂片呈现大量无核角化上皮细胞，动情周期紊乱则提示模型建立成功。造模结束后剔除5只不成模大鼠，其余大鼠均造模成功。

2.2 动物分组及干预 将成模的19只大鼠随机分为模型组10只，补肾健脾组9只。按大鼠给药剂量为人的6.3倍换算［8］，补肾健脾组予补肾健脾方10 mL/（kg·d）灌胃，正常组和模型组予等体积生理盐水灌胃，每日1次，共4周。

2.3 标本采集 动物实验结束后，禁食不禁水12 h，称取大鼠体质量，用2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉。取腹主动脉血，室温静置1 h，低温冷冻离心机3 000 r/10 min离心，抽提血清，-20℃冰箱冻存；断头处死后，分离双侧卵巢，剥离干净脂肪、结缔组织，以4℃PBS缓冲液清洗残血，滤纸滤干，一侧卵巢固定于4%多聚甲醛溶液，于4℃冰箱保存，另一侧卵巢放入冻存管，-80℃冰箱保存。

3 指标检测

3.1 动情周期观察 中药干预最后4 d，每日早晨10∶00采集大鼠阴道脱落细胞。无菌棉签用生理盐水蘸湿后轻柔插入大鼠阴道转动2圈取出，均匀涂抹于提前编号的载玻片上，95%乙醇固定后HE染色，光镜下观察阴道脱落细胞涂片，判断动情周期变化。

3.2 卵巢组织病理形态 将固定于4%多聚甲醛溶液中的卵巢取出，纱布块扎牢后流水冲洗6 h，行梯度乙醇脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、拷片，经脱蜡、水化、封片后光镜下观察3组大鼠卵巢卵泡数量及形态学变化。

3.3 体质量增量与卵巢指数 根据3组大鼠实验前后体质量差值计算体质量增量。用精密电子天平称取卵巢湿重，计算卵巢指数。

卵巢指数/%＝卵巢湿重/大鼠体质量×100%

3.4 血清FSH、E2、GnRH、AMH含量检测 上述备用血清按照酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒说明书操作后，放入酶标仪用450 nm波长测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样本实际浓度，检测FSH、E2、GnRH、AMH的含量。

3.5 卵巢组织Akt、mTOR mRNA相对表达量检测

用Trizol抽提卵巢组织RNA，测定纯度和浓度后逆转录为cDNA，并进行实时荧光定量PCR（q-PCR）检测。反应条件：95℃2 mim预变性；95℃15 s变性，60℃1 min退火延伸，40个循环。以β-actin为内部参照，2-△△ct法计算Akt和mTOR mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

3.6 统计学方法 用SPSS 23.0软件处理数据。计量资料属正态分布的以（±s）表示，采用单因素方差分析；不符合正态分布的采用秩和检验。

4 结 果

4.1 3组大鼠动情周期比较 正常组大鼠动情周期各期循环时间基本一致；模型组大鼠动情周期呈现紊乱状态，动情期延长，失去规律性变化；补肾健脾组大鼠动情周期缩短且趋向于规律，动情期无核角化上皮细胞数量增多。见图1。

图1 3组大鼠动情周期阴道脱落细胞HE染色图（×100）

4.2 3组大鼠卵巢组织形态比较 正常组大鼠卵巢结构清晰，可见各级发育良好的卵泡，颗粒细胞层次多，卵泡液含量多，血管丰富，闭锁卵泡很少；模型组大鼠卵巢体积较小，卵泡内部结构破坏，闭锁卵泡数量较多，生长卵泡数量少，未见成熟卵泡，黄体较多；补肾健脾组大鼠卵巢组织病理形态明显改善，可见少量闭锁卵泡，生长卵泡与成熟卵泡数量增加，卵泡液含量增多。见图2。

图2 3组大鼠卵巢组织HE染色图（×100）

4.3 3组大鼠体质量增量及卵巢指数比较 见表2。

表2 3组大鼠体质量增量与卵巢指数比较（±s）

表2 3组大鼠体质量增量与卵巢指数比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

卵巢指数/%0.036±0.007 0.029±0.0091）0.037±0.0072）组别正常组模型组补肾健脾组n 10 10 9体质量增量/g 53.90±13.51 40.24±10.501）45.63±9.03

4.4 3组大鼠血清FSH、E2、GnRH、AMH含量比较见表3。

4.5 3组大鼠卵巢组织Akt、mTOR mRNA相对表达量比较见图3。

5 讨 论

POF根据其闭经、不孕、类围绝经期综合征的临床表现归属中医“血枯”“经水早断”等范畴。先天肾精与脾胃运化的水谷精微皆为卵巢、卵泡发育过程中关键的物质基础，若脾肾亏虚，冲任失调，天癸耗竭，则卵巢卵泡无以为养，经水渐断，酝酿成病。补肾健脾方具有补肾健脾、益气滋阴的功效，是临床治疗POF的常用方剂，疗效显著，然而作用机制尚不明确。

表3 3组大鼠血清FSH、E2、GnRH和AMH含量比较（±s）

表3 3组大鼠血清FSH、E2、GnRH和AMH含量比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。

AMH/（pmol/L）2 338.60±299.53 800.83±310.011）1 544.17±725.402）组别正常组模型组补肾健脾组n 10 10 9 FSH/（mIU/mL）5.92±0.92 11.98±1.161）8.91±2.742）E2/（pg/mL）60.62±6.90 27.80±5.551）49.23±6.422）GnRH/（mIU/mL）45.84±9.66 96.06±8.041）68.77±8.422）

动情周期变化与激素水平高低关系密切，激素分泌水平又能直接影响卵泡生长情况和卵巢组织形态。AMH是由卵巢颗粒细胞分泌的二聚体糖蛋白，可有效抑制卵泡过速发育，防止卵泡过早消耗［9］，血清AMH水平是预测POF较准确的内分泌指标。AMH的生成和FSH活性之间存在互为依赖的密切关系，可以反映早期卵泡数量，用于评估女性卵巢储备功能。本实验结果显示：POF大鼠卵巢指数与AMH含量均下降，动情周期延长、紊乱，闭锁卵泡数量增加，反映出卵巢储备能力低下；补肾健脾方治疗后，卵巢指数与AMH的含量升高，动情周期趋于正常，卵巢形态结构改善，生长卵泡数量增多。这提示补肾健脾方能促进卵巢形态与功能的恢复，促进生长卵泡发育，提高卵巢储备功能。

下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）是女性生殖系统至关重要的神经内分泌调节体系，E2是HPG轴上非常重要的性激素且受到FSH调节，有助于生殖器官的发育和卵泡成熟。下丘脑脉冲式分泌GnRH，直接促进垂体前叶促性腺激素分泌，二者共同调节E2水平以达到调控卵巢功能的目的［10］。PI3K/Akt/mTOR信号通路对HPG轴具有调控作用，Akt是PI3K的下游效应因子，同时也是mTOR激活的关键性因子，其通过磷酸化的mTOR丝氨酸448位点来激活mTOR，mTOR被激活后刺激E2分泌，以维持卵巢正常组织形态与功能［11-12］。本实验结果显示：POF大 鼠FSH、GnRH水平升高，E2含量与Akt、mTOR mRNA表达均降低；补肾健脾方治疗后，大鼠FSH、GnRH水平下降，Akt、mTOR mRNA表达均增强，促使E2趋向正常。这说明补肾健脾方能够显著调节POF大鼠HPG轴功能，影响激素释放水平，对POF大鼠具有明显的治疗效应。

综上所述，补肾健脾方可以调节POF大鼠血清FSH、E2、GnRH、AMH激素水平，促进Akt、mTOR mRNA表达，从而改善卵泡发育情况，促使成熟卵泡增加，提高卵巢储备功能，其作用机制可能与上调PI3K/Akt/mTOR信号通路中下游基因Akt、mTOR mRNA表达，进而调控下丘脑-垂体-性腺轴功能相关。