壮骨健膝方含药血清对经IL-1β诱导的大鼠膝关节退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路抑制因子蛋白表达的影响

郭洁梅，陈秀明，陈 鹏，肖 艳，毛 骁，苏友新*

（1.福建卫生职业技术学院，福建 福州350101；2.福建中医药大学，福建 福州350122；3.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州350003）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以关节软骨退变、滑膜炎症为主要病理改变的退行性疾病。已有研究表明Wnt/β-catenin信号通路的激活与软骨退变的发生、发展密切相关［1］。课题组前期对大鼠膝关节软骨细胞的体外研究也证实，经白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的退变软骨细胞可抑制Ⅱ型胶原蛋白的表达水平，并伴有β-catenin蛋白表达增多，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）mRNA表达减少［2］，提示经IL-1β诱导的退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路被激活。课题组针对KOA的临床效验方—壮骨健膝方能提高经IL-1β诱导的退变软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的表达，降低β-catenin蛋白的表达，提高GSK-3βmRNA的表达［3］，表明该方可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活起到保护关节软骨的作用。Dickkopf相关蛋白1（Dkk-1）、分泌型卷曲相关蛋白3（sFRP-3）是Wnt/β-catenin信号通路活动的抑制因子［4-5］。本实验通过壮骨健膝方含药血清对经IL-1β诱导的大鼠膝关节退变软骨细胞进行干预，观察不同时间段Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平的变化，探讨壮骨健膝方是否通过调控Dkk-1、sFRP-3这两个蛋白的表达水平，抑制Wnt/β-catenin信号通路被激活，进一步研究壮骨健膝方保护关节软骨的可能分子机制。

1 实验材料

1.1 实验动物40只清洁级2周龄SD大鼠，雌雄各半，用于血清的制备；5只清洁级2周龄雄性SD大鼠，用于体外生长良好的第三代软骨细胞的取材。大鼠均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号：SCXK（沪）2007-0005。大鼠在福建中医药大学动物实验中心饲养，动物环境合格证号：SCXK（闽）2009-0001。实验前均适应性喂养1周。

1.2 主要试剂及仪器0.25%胰蛋白酶、低糖DMEM培养基、10%胎牛血清（美国Hyelone公司）；Dkk-1抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；sFRP-3抗体（美国R&D公司）；青霉素-链霉素溶液（美国Thermo Scientific公司）；内参β-actin、蛋白浓度检测试剂盒、Western Blot检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；凝胶成像系统、BIO-TEKELX 800型全自动酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

2 实验方法

2.1 壮骨健膝方药液制备 壮骨健膝方由桑寄生15 g，骨碎补15 g，川牛膝15 g，杜仲9 g，独活9 g，土鳖虫6 g，生地黄15 g，秦艽9 g，鹿衔草10 g，肿节风10 g组成，均购于福建中医药大学国医堂。制备方法：中药首煎用500 mL冷水浸泡20 min后，用武火煮沸后转为文火再煮20 min；次煎再加水500 mL，武火煮沸后转文火再煮30 min；将2次煎得的药液混合，采用旋转蒸发仪浓缩成含生药1 g/mL的药液，用玻璃瓶密封，置于4℃冰箱保存备用。

2.2 大鼠含药血清、空白血清制备 采用随机数字表法将40只清洁级2周龄SD大鼠取20只，按人和大鼠体表面积换算法计算，予9.84 mL/（kg·d）壮骨健膝方药液灌胃，其余20只予等体积生理盐水灌胃，每日2次，连续灌胃5 d。于末次灌胃3 h后于大鼠腹主动脉采血，2 500 rpm离心25 min，分离血清，于56℃水浴灭活30 min，过滤，分装，分别为大鼠含药血清与空白血清，置于-20℃冰箱保存备用。

2.3 模型制备和分组

2.3.1 大鼠膝关节软骨细胞的分离、原代及传代培养 选取5只清洁级2周龄大鼠，采用10%水合氯醛麻醉后脱颈处死，取双膝关节面软骨并清除残留组织，将软骨小块剪至1 mm3大小，加0.2%Ⅱ型胶原酶3 mL，置37℃培养箱中进行消化，每2 h取1次上清液；悬浮液离心后收集软骨细胞，共分离收集3次；收集到的软骨细胞用含10%胎牛血清（FBS）及青霉素-链霉素溶液各100 U/mL的培养液重悬，调整细胞悬液浓度为3×105个/mL，后接种于25 cm2细胞培养瓶中；倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况，每2～3 d更换1次培养液，待软骨细胞铺满培养瓶底部80%后，进行传代培养。

2.3.2 模型制备及分组 取第三代生长良好的软骨细胞按2.5×105个/mL的密度接种在2块六孔板中，采用含10 ng/mL IL-1β的10% FBS/DMEM培养基干预24 h后，随机取3孔，依据课题组前期研究已形成的经IL-1β诱导的退变软骨细胞制备方法［2］进行模型鉴定。模型成功鉴定标准：在倒置显微镜下软骨细胞形态显示为成纤维样、长梭形，胞浆间隙变大，可见脂滴；经甲苯胺蓝染色可见细胞外及基质紫红色易染颗粒减少；经Ⅱ型胶原染色后提示Ⅱ型胶原表达减少。模型制备成功后，将剩下的9孔采用抽签法取6孔，再采用数字随机法将其分为空白血清组和含药血清组，每组各3孔。

2.4 退变软骨细胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平检测 空白血清组采用含10%大鼠空白血清的DMEM培养液培养，含药血清组采用10%大鼠含药血清的DMEM培养液培养。2组分别于培养24、36、48、72 h时，采用Western Blot法检测其中的Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平。具体步骤：RIPA裂解液裂解2组软骨细胞并提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、转移至PVGF膜，5%脱脂奶粉封闭；分别加一抗、二抗孵育，经ECL发光，在凝胶成像仪下显影、拍照，并使用凝胶图像分析计算2个蛋白与内参二者的光密度比值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据处理。计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用秩和检验。

3 结 果

2组退变软骨细胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平比较 见图1、表1。

图1 2组退变软骨细胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白电泳图

表1 2组退变软骨细胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平比较（±s）

表1 2组退变软骨细胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平比较（±s）

注：与24 h比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与36 h比较，3）P＜0.05；与空白血清组同一时间点比较，4）P＜0.05，5）P＜0.01。

时间24 h 36 h 48 h 72 h 24 h 36 h 48 h 72 h组别空白血清组含药血清组n 3 3 Dkk-1 1.150±0.193 1.052±0.135 0.811±0.0981）0.793±0.1831）1.290±0.277 1.383±0.1131）4）1.652±0.3082）3）5）1.707±0.0932）3）5）sFRP-3 2.424±0.382 2.379±0.301 2.156±0.4961）2.101±0.4951）2.433±0.213 2.613±0.2631）4）2.871±0.1112）3）5）2.926±0.4662）3）5）

4 讨 论

Wnt/β-catenin通路系统的激活在KOA关节软骨退变过程扮演着重要角色，在关节软骨形态与功能的维持方面起着非常重要的作用，一直是关节软骨病变研究的热点［6］。该通路的激活会通过多途径促进软骨细胞的破坏，加速软骨的退变，进而影响关节的结构与功能。

壮骨健膝方是课题组在梳理大量文献及多年临床实践的基础上，针对改善KOA临床表现而创立的效验方，该方由骨碎补、杜仲、桑寄生、独活等组成，可补肝肾，强筋骨，通络止痛，临床疗效显著［7-8］。前期通过动物实验研究证实：该方可通过促进软骨细胞增殖及合成胶原、抑制软骨的降解等起到保护关节软骨的作用［3］。此外，该方还可抑制Wnt/βcatenin信号通路的激活并减少下游产物对软骨细胞及基质的损害［9］，但对该信号通路激活过程的具体抑制环节还不明确。DKK-1是一种分泌型蛋白，通过与其相应的受体结合来抑制Wnt/β-catenin信号在细胞内的传递，从而抑制Wnt/β-catenin信号激活［10-11］。sFRPs是Wnt信号通路分泌型拮抗剂的最大家族，研究表明sFRP-3可通过半胱氨酸区域（CRD）与主要的Wnt蛋白受体结合形成无功能复合体，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路传导，在骨代 谢 方 面 作 用 明 显［12］。因 此，我 们 选 择DKK-1、sFRP-3做为观察指标，旨在探讨壮骨健膝方在Wnt/β-catenin信号通路跨膜信号传递阶段对该通路激活的影响。

本研究结果显示：空白血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平随着时间而逐渐下降，48 h和78 h均显著低于24 h（P均＜0.05），证实了经IL-1β诱导后的大鼠膝关节软骨细胞退变伴有Wnt/β-catenin通路激活，这与我们前期研究结果一致。经壮骨健膝方含药血清干预后，在一个细胞培养期内，含药血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平随着干预时间的延长而逐渐增强，其中干预36 h高于24 h（P＜0.05），干预48 h和72 h显著高于24 h（P均＜0.01），干预48 h和72 h高于36 h（P均＜0.05）；与空白血清组同一时间点比较，含药血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平在干预36 h、48 h和72 h时均显著增高（P＜0.05或0.01）。提示壮骨健膝方含药血清能够增加Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平，抑制Wnt/βcatenin信号通路被激活。

本研究从Dkk-1、sFRP-3在Wnt/β-catenin信号通路的作用环节分析而知，壮骨健膝方含药血清可能对Wnt/β-catenin信号通路的激活有抑制作用，揭示了壮骨健膝方保护膝关节退变软骨细胞的可能分子机制，为该方的临床应用提供了进一步的实验依据。然而，与其他复方相似，壮骨健膝方具有多成分、多靶点特点，本研究仅从增加Wnt/βcatenin信号通路抑制因子Dkk-1、sFRP-3蛋白表达水平探讨该方保护膝关节退变软骨细胞的分子机制，具有一定的局限性。