靶向沉默CaMKK-AMPK通路对NEFAs介导肝脂损伤的调控机制

王 爽，任大禹，张睿锴，杨 威，张冰冰，董志昊，赵莹莹，麻芯茹，徐 闯*

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已成为在部分发达国家及我国常发的一种代谢性疾病[1]，其疾病发展过程为最初单纯的肝脂肪变性到脂肪型肝炎(NASH)，进而转变为肝硬化、肝细胞癌甚至最终导致失代偿性肝病的发生，对机体健康造成较大威胁及损害。研究表明，患有NASH的患者其肝脏内脂肪酸通量出现明显增加的趋势[2]。非酯化脂肪酸(NEFA)及其代谢产物是脂质毒性的重要介质，其通过诱导脂质过度积聚从而导致肝细胞脂毒性损伤以及NAFLD发展[3]。

非酯化脂肪酸(NEFAs)作为某些代谢性疾病中炎症反应的重要诱导因子，参与小鼠的肝脂代谢过程。相关研究表明，过量的NEFAs会导致肝细胞内脂滴积聚、肝肿大和炎症(脂肪性肝炎)等疾病发生[4]。甾醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为一种与内质网(ER)结合的非活性前体，是脂肪生成的重要转录调节因子，在机体内具有促进调节脂肪酸合成和脂蛋白摄取的功能。在一项有关大鼠的研究中证明，过量的NEFAs可明显损害线粒体的呼吸链进而增加活性氧(ROS)的产生[3]。ROS作为氧化应激的标志物能够引起脂质过氧化的发生并引起炎症。

AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在真核细胞的细胞能量平衡中起着重要作用[5],除维持细胞内能量平衡外，AMPK还调节全身能量代谢，参与机体多项生命活动调节。相关研究表明，AMPK调节全身能量代谢是通过抑制胆固醇和脂肪酸的合成这一途径来完成的。因此，其在代谢综合征等相关疾病的发生发展中起着关键作用。

Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMKK)作为AMPK上游激活和调控的重要因子，调节多种生理及病理生理过程[6]。但是针对于在高NEFAs状态下CaMKK通过AMPK途径对机体相关影响的研究较少，因此本试验采用添加NEFAs刺激小鼠肝细胞并通过RNA靶向沉默CaMKK来探究CaMKK在高NEFAs状态下通过AMPK信号通路调控下游基因对小鼠氧化应激、脂滴形成以及肝脂沉积等肝脂损伤过程的影响，为临床中某些肝脏代谢障碍或异常的疾病提供一定的研究方向及治疗思路。

1 材料与方法

1.1 细胞试验中所用的细胞为小鼠肝细胞系AML12细胞，购自中国科学院细胞库，保存于黑龙江八一农垦大学生物技术中心216室。

1.2 主要试剂及药品NEFAs购自Sigma公司；DMEM高糖含丙酮酸钠干粉培养基、青链霉素均购自Gibco公司；胎牛血清购自Clark公司；胰酶、PBS、BSA均购自Biosharp公司；ROS含量测定试剂盒购自北京普利莱公司；AMPK、SREBP1、β-actin抗体购自CST公司；HRP标记二抗、显影发光液均购自碧云天公司；Bodipy 493/503荧光染料购自Invitrogen公司；CaMKK siRNA购自上海Gene Pharma有限公司。

1.3 AML12细胞的培养与处理AML12细胞接种于6孔培养板106/孔，使用DMEM高糖培养基(10%胎牛血清、1%青链霉素、1% ITS液体培养基补充剂、40 μg/L地塞米松)，于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。将生长状态良好的AML12细胞分为空白对照组、siCaMKK组、NEFAs组、siCaMKK+NEFAs组，共4组，置于无血清无青链霉素培养基中孵育2 h，各组加入不含青链霉素的2%BSA培养基培养。siCaMKK组及siCaMKK+NEFAs组用30 nmol/L小鼠CaMKK siRNA根据制造商的方案使用siRNA-Mate转染试剂分别培养24,12 h后在siCaMKK+NEFAs组和已在不含青链霉素的2%BSA培养基中培养12 h的NEFAs组中加入使用RPMI-1640碱性培养基稀释的浓度为1.2 mmol/L 的NEFAs培养12 h后收取各组细胞。

1.4 AML12细胞中AMPK、SREBP1水平检测收取细胞加入含有1%蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液RIPA，漩涡振荡数秒后，置于冰上10 min后重复漩涡振荡操作数秒，重复上述操作3次。使其裂解充分后4℃、14 000 r/min离心10 min后取上清，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度并进行蛋白定量。蛋白样品与上样缓冲液以4∶1的比例混合，经10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，利用湿转法以100 V恒压置于电转缓冲液中电转60 min。将带有蛋白条带的PVDF膜放入5%脱脂牛奶中封闭1 h。分别孵育多克隆AMPK、SREBP1一抗4℃过夜。孵育结束后使用TBST(Tris缓冲液，pH7.5，0.1%Tween 20)摇床洗涤3次，5 min/次。随后利用相应兔二抗及鼠二抗室温孵育1 h后回收二抗，使用TBST于摇床上清洗5次，10 min/次。利用Protein Simpie System进行显影检测，使用Image Lab软件分析比较不同处理后各蛋白的表达量变化情况。

1.5 AML12细胞中ROS水平的检测按1.3中方法将各组细胞处理完毕后，胰酶消化细胞，用含10 μmol/L DCFH-DA荧光探针的无血清无青链霉素培养基在37℃、5%CO2培养箱中避光染色20 min，加入改良台式液后1 500 r/min离心5 min，清洗2次后，利用流式细胞仪上机检测。

1.6 脂滴染色将AML12细胞接种于细胞爬片上，控制细胞接种密度为2×105～4×105/孔。按1.3中描述方法处理细胞后弃上清，PBS缓冲液去除残留培养基，PBS吸除干净后利用4%多聚甲醛固定30 min；PBS缓冲液冲洗3次，Bodipy493/503染料避光染色30 min；PBS缓冲液冲洗3次，5 min/次。之后使用Hoechst染料避光染色8 min，PBS缓冲液冲洗3次，甘油封片后利用激光共聚焦显微镜拍照。

1.7 数据分析采用SPSS22.0统计学软件，运用One-way ANOVA检测方法进行显著性分析，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示极显著性差异。

2 结果

2.1 siCaMKK对NEFAs刺激AML12细胞AMPK、SREBP1蛋白表达的影响结果见图1，NEFAs组AMPK蛋白表达水平极显著低于空白对照组，SREBP1蛋白表达水平极显著高于空白对照组。siCaMKK组及siCaMKK+NEFAs组AMPK蛋白表达水平极显著低于空白对照组，SREBP1蛋白表达水平极显著高于空白对照组。siCaMKK组AMPK蛋白表达水平极显著高于NEFAs组，而siCaMKK+NEFAs组AMPK蛋白表达水平极显著低于NEFAs组。siCaMKK组及siCaMKK+NEFAs组SREBP1蛋白表达水平均极显著高于NEFAs组。

A.Western blot 结果；B.AMPK相对表达水平；C.SREBP1相对表达水平。*示与空白对照组相比P<0.05，**示与空白对照组相比P<0.01；#示与NEFAs组相比P<0.05，##示与NEFAs组相比P<0.01。下同

2.2 siCaMKK对AML12 细胞ROS含量的影响结果见图2，NEFAs组、siCaMKK组ROS水平较空白对照组显著升高且siCaMKK+NEFAs组ROS水平极显著的高于空白对照组。siCaMKK+NEFAs组ROS水平极显著的高于NEFAs组。

2.3 siCaMKK对AML12 细胞脂滴的影响结果见图3，NEFAs组及siCaMKK组脂滴较空白对照组增多，且siCaMKK+NEFAs组脂滴数量明显多于其他各组。

A.流式细胞图；B.柱状图

图3 RNA靶向沉默CaMKK对NEFAs刺激AML12细胞脂滴的影响

3 讨论

NAFLD多由过量摄入或血液大量NEFAs进入肝脏，导致甘油三酯蓄积所致，肝脂蓄积对肝脏及其他组织造成严重损伤，并增加了机体患糖尿病、心血管疾病的风险[7]。本试验通过添加浓度为1.2 mmol/L NEFAs刺激AML12细胞，检测SREBP1蛋白水平、脂滴特征，显示高浓度的NEFAs可导致肝细胞脂肪酸从头合成水平升高，进而导致肝脂蓄积。同时通过检测AMPK蛋白表达水平，表明高浓度NEFAs的刺激可导致肝细胞AMPK蛋白表达水平明显降低。AMPK对代谢的影响包括抑制合成代谢以及刺激分解代谢两部分。其刺激分解代谢过程均可通过刺激脂肪酶释放脂肪酸，进一步促进游离脂肪酸进入线粒体进行β-氧化，从而促进脂肪分解[8]。CaMKK作为确定的AMPK级联反应上游激酶，本试验通过RNA靶向沉默CaMKK降低AMPK表达水平，结果显示siCaMKK加重了小鼠肝细胞肝脂蓄积，同时SREBP1蛋白表达水平升高，表明AMPK可能通过调控SREBP1进而调节肝脂代谢过程。

线粒体作为细胞的动力，在脂肪酸(FA)和葡萄糖等代谢物的最终氧化中起关键作用。研究表明大量脂肪酸进入线粒体，使线粒体内的脂质过量导致部分氧化的酰基肉碱积累，线粒体过氧化氢(H2O2)排放增加，这表明肝细胞脂质氧化水平较高[9]，导致ROS水平升高。另一方面，大量脂肪酸从头合成导致肝脂蓄积，进而加重脂质过氧化水平，导致线粒体功能损伤以及ROS水平升高[10]。本研究通过RNA靶向沉默CaMKK降低AMPK表达水平后ROS水平显著高于NEFAs组，高浓度的NEFAs作用下肝细胞内脂质过氧化和合成同时增加，肝细胞主要通过肝脂蓄积的形式储存过量的脂肪酸，进而相对减弱线粒体脂质过氧化水平从而减少肝脂损伤。

综上所述，CaMKK基因可通过AMPK信号通路调控SREBP1参与并调节细胞脂质代谢过程，并通过线粒体途径调节肝细胞在高浓度NEFAs刺激状态下的氧化应激过程，减少肝脂损伤。因此，本试验提示可以通过调控CaMKK调节细胞氧化应激、脂沉积等生物过程，以降低高浓度NEFAs刺激对AML12细胞的损伤。