地衣芽孢杆菌对热应激公兔甲状腺和甲状旁腺组织的影响

韩 昱，张立永，张富梅，冯宇飞，金圆圆

(1.河北北方学院 实验动物中心,河北 张家口 075000；2.河北北方学院 动物科技学院,河北 张家口 075000)

在家兔养殖过程中，应激是造成公兔生殖机能下降的直接原因之一[1-2]，据报道，热应激使公兔甲状腺的组织结构处于功能低下状态，从而影响T3和T4的正常分泌，降低精液品质[3-4]。热应激给家兔带来的不利影响，大大降低了种兔的利用价值，严重制约了养兔业的发展。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) 是芽孢杆菌中具有较强应用潜力的益生菌之一，在日粮中添加地衣芽孢杆菌可促进畜禽的生长[5-7]，改善肠道黏膜形态，促进有益菌的增殖，增强机体抗热应激能力[8-9]。虽然对热应激的研究报道较为普遍，但是关于地衣芽孢杆菌对热应激家兔甲状腺的影响尚未见报道。本试验通过光镜和电镜观察公兔甲状腺结构变化，揭示地衣芽孢杆菌在抗热应激中的作用机理，为生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 基础饲粮、活菌制剂及试验动物基础饲粮原料为玉米38%、麸皮7%、豆粕17%、苜蓿草粉24%、燕麦12%、骨粉1%、其他1%，制成颗粒饲料。营养成分：消化能(DE)11.09 MJ/kg，粗蛋白(CP)17.06%，粗纤维(CF)10.05%。地衣芽孢杆菌活菌制剂的活菌含量为 2×1010CFU/g，购于北京挑战生物技术有限公司；试验动物为年龄相同、体质量3.5～4.5 kg、体况良好的成年塞北兔种公兔。

1.2 试验设计选择18只种公兔，随机分为常温组、热应激对照组和地衣芽孢杆菌试验组，每组6只。常温组兔舍温度控制在20～25℃，热应激对照组和地衣芽孢杆菌试验组兔舍温度模拟炎热夏季温度变化，采用全自动智能控温电加热暖风机调节温度。9:00-12:00温度控制在26～32℃，12:00-16:00温度控制在33～35℃，16:00-22:00温度控制在28～30℃，22:00-3:00温度控制在26～28℃，凌晨3:00-9:00温度控制在25～26℃。公兔单笼饲养，常温组和热应激对照组饲喂基础饲粮，地衣芽孢杆菌试验组饲喂基础饲粮+1 000 mg/kg地衣芽孢杆菌(前期试验已完成添加量梯度筛选工作[10])。7 d 预试期后转为正试期饲喂15 d，保证兔舍的清洁卫生，定期消毒。

1.3 测定指标与观察

1.3.1血浆皮质醇含量和甲状腺指数测定 分别于试验前及试验5,10,15 d采集兔血液，制备血浆，测定血浆皮质醇含量(放射免疫法)。在试验期末空腹12 h后测体质量，摘取甲状腺测其质量，计算甲状腺指数。

1.3.2光镜下观察甲状腺组织 取1.3.1中部分甲状腺组织固定于4%甲醛磷酸缓冲液中(pH7.2～7.4)，待充分固定后，按照常规方法进行7次酒精脱水、二甲苯透明及石蜡包埋，制作切片，HE染色后，采用YD300型数字摄像机及图像处理系统分析甲状腺组织变化情况。

1.3.3透射电镜观察甲状腺细胞变化 取1.3.1中部分甲状腺组织，采用2.5%戊二醛固定24 h以上，用磷酸缓冲液漂洗，再用1%饿酸固定，不同浓度的乙醇脱水，然后包埋、固化，做超薄切片，用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，采用JEMCXⅡ型透射式电子显微镜观察其超微结构。

2 结果

2.1 地衣芽孢杆菌对热应激公兔血浆皮质醇和甲状腺指数的影响

2.1.1地衣芽孢杆菌对热应激公兔血浆皮质醇的影响 由表1可知，在试验前测定各组血浆皮质醇水平差异均不显著(P>0.05)。5，10 d热应激对照组和地衣芽孢杆菌组均极显著高于常温组(P<0.01)，且热应激对照组高于地衣芽孢杆菌组有显著性差异(P<0.05)。15 d热应激对照组继续下降，但显著高于地衣芽孢杆菌组(P<0.05)，极显著高于常温组(P<0.01)，地衣芽孢杆菌组显著高于常温组(P<0.05)。

2.1.2地衣芽孢杆菌对热应激公兔甲状腺指数的影响 由表2可知，常温组、热应激对照组和地衣芽孢杆菌组甲状腺质量和甲状腺指数两两比较有极显著性差异 (P<0.01)；热应激公兔甲状腺质量和指数为常温组>地衣芽孢杆菌组>热应激对照组。

2.2 地衣芽孢杆菌对热应激种公兔甲状腺组织结构变化的影响结果见图1。常温组在试验15 d、10×10倍光镜下观察甲状腺组织无明显变化，滤泡形态呈少量圆形或较多扁椭圆形，滤泡边缘整齐光滑，直径20～65 μm，滤泡基膜由单层上皮细胞构成，细胞核呈圆形或卵圆形，偏于滤泡基膜处；胞内基质为嗜酸性染色，基质中可见有散在的滤泡上皮细胞；滤泡旁细胞分布较广，存在于滤泡之间或上皮细胞之间，血管窦清晰可见。热应激对照组滤泡变化较大，滤泡基膜不规则，有的基膜破裂，分界不明显，可略见滤泡上皮存在，旁细胞少而不完整；基膜上皮细胞核及旁细胞核溶解，观察不到完整的细胞结构，血管破裂。地衣芽孢杆菌组部分滤泡分界不清，滤泡上皮细胞较为清晰，旁细胞较多，血管窦较为清晰可见。

表2 地衣芽孢杆菌对热应激公兔甲状腺指数的影响

2.3 地衣芽孢杆菌对热应激公兔甲状腺滤泡上皮细胞超微结构的影响结果见图2。试验公兔电镜下常温组甲状腺滤泡上皮细胞结构清晰，细胞膜结构完整，细胞之间通过桥粒连接，细胞核大而圆，染色质常染色质较多，且分布均匀，胞质中含有丰富的溶酶体、高尔基体和线粒体，线粒体为短杆状发育正常，粗面内质网较发达，含有少量胶质小泡。地衣芽孢杆菌组与常温组比较，细胞核缩小，细胞核异染色质增多，且边集，出现初级溶酶体，线粒体嵴扩张，断裂，空泡化较为明显，高尔基体和粗面内质网较为发达。热应激对照组滤泡上皮细胞变化显著，多呈扁平状，细胞核萎缩严重，小而扁平，边缘皱缩，核内异染色质增多；胞质中可见断裂的粗面内质网，胞质空泡化较为明显；少见高尔基体，斑马体样溶酶体较多；线粒体嵴断裂，扩张空泡化严重。

A.常温照;B.地衣芽孢杆菌组;C.热应激组

A.常温照;B.地衣芽孢杆菌组;C.热应激组

2.4 地衣芽孢杆菌对热应激公兔甲状旁腺嗜酸性细胞超微结构观察结果见图3。常温组甲状旁腺嗜酸性细胞胞质中线粒体丰富，圆形短杆状较多，嵴明显；粗面内质网和高尔基体不发达。地衣芽孢杆菌组细胞核异染色质边集，细胞膜较为清晰，线粒体嵴轻微扩张，可见扩张的内质网。热应激组嗜酸性细胞核固缩明显，核内异染色质增多，线粒体嵴断裂，空泡化程度高，线粒体颗粒增多。

A.常温组甲状旁腺嗜酸性细胞；B.地衣芽孢杆菌组甲状旁腺嗜酸性细胞；C.热应激组甲状旁腺嗜酸性细胞；D.热应激组甲状旁腺嗜酸性细胞线粒体基质颗粒增多

3 讨论

3.1 地衣芽孢杆菌对血浆皮质醇和甲状腺指数的影响热应激可引起机体发生一系列生理反应，它通过下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴系统合成和分泌激素来实现对机体的影响。据报道，给大鼠35～38℃持续热应激能显著提高大鼠血清皮质醇含量，热应激1 d后达到高峰，以后开始逐渐降低[11]。另据报道，长时间热应激可使下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴处于长期亢奋状态，功能失常，引起皮质醇分泌下降[12]。本试验结果与前者研究略有区别，与后者报道相一致。本试验是模拟夏季高温对家兔持续热应激，热应激对照组5 d时血浆皮质醇含量极显著高于常温组，且达到高峰，随着热应激持续时间的延长血浆皮质醇含量逐渐降低，到15 d时略高于常温组，表明长时间热应激引起了下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴机能减退，皮质醇合成分泌减少。而饲粮中添加地衣芽孢杆菌能明显缓解这种变化趋势，显示出地衣芽孢杆菌的抗热应激作用。

热应激也可通过下丘脑-垂体-甲状腺轴系统来影响甲状腺的分泌功能，甲状腺分泌的甲状腺激素具有促进机体代谢、增加机体产热的作用，参与机体对冷热的调节。热应激对畜禽影响的作用机制报道较为多见[13-14]。本试验结果表明，经过高温处理后的试验公兔，可使甲状腺质量下降，甲状腺指数降低，与参考文献[15] 中热应激可使甲状腺萎缩结果相一致。甲状腺的实质主要由许多甲状腺滤泡组成，而滤泡基膜由许多单层上皮组成，热应激使其单层上皮细胞胞核及旁细胞核溶解，胞膜轮廓边界不清，胞质出现空泡化明显，因此改变了滤泡的形态结构，影响甲状腺激素T3、T4的合成和分泌，这是导致公兔生殖机能降低的原因。本试验结果显示，地衣芽孢杆菌组可提高甲状腺指数，缓解滤泡上皮细胞核溶解核胞质发生空泡化的速度，保持滤泡上皮细胞的完整性。

3.2 地衣芽孢杆菌对甲状腺滤泡上皮细胞和甲状旁腺嗜酸性细胞超微结构的影响甲状腺滤泡上皮细胞是产生甲状腺素的重要场所。本试验电镜观察结果显示，热应激时滤泡上皮细胞核萎缩严重，胞质中粗面内质网断裂明显，线粒体减少，扩张空泡化严重，斑马体样溶酶体增多，胞质空泡化严重，证明了热应激对甲状腺的影响程度。热应激时细胞氧化磷酸化减少，使细胞缺少能量的供应，蛋白质合成受阻，从而影响细胞的结构和功能，这一观点从前期甲状腺血浆T3、T4降低的测定结果也可得到验证[10，16-17]。而地衣芽孢杆菌组电镜下甲状腺滤泡上皮细胞变化较热应激组小，溶酶体较多，有初级溶酶体出现，线粒体嵴扩张轻微，高尔基体和粗面内质网较为发达，说明热应激下饲粮添加地衣芽孢杆菌对维持细胞的结构与功能的完整性起积极作用。甲状旁腺中的嗜酸性细胞可能与疾病的发生有关，本试验中热应激组甲状旁腺嗜酸性细胞电镜观察核固缩明显，核内异染色质增多，线粒体嵴断裂，空泡化程度高，线粒体颗粒增多。而地衣芽孢杆菌组嗜酸性细胞变化较热应激组轻，细胞膜较为清晰，线粒体嵴出现轻微扩张，有不发达的粗面内质网存在，说明地衣芽孢杆菌在饲粮中添加有利于提高机体抵抗力，恢复机体正常的生理功能 。

本试验结果表明，在热应激种公兔饲粮中添加1 000 mg/kg的地衣芽孢杆菌，可显著降低热应激公兔血浆皮质醇含量，缓解热应激对甲状腺的损伤，对保持甲状腺滤泡上皮细胞形态和功能的完整性起决定作用，对热应激造成的甲状旁腺嗜酸性细胞损伤也有缓解作用。