罗定地区临床耐碳青霉烯G-杆菌常见碳青霉烯酶基因检测及流行病学研究

莫家金 聂 璐

1.广东省罗定市人民医院检验科，广东罗定 527300；2.广东省佛山市第一人民医院，广东佛山 528010

近年来随着抗生素的广泛使用，细菌对抗生素的耐药性也不断提高[1]。耐碳青霉烯G-杆菌（CRGNB）是一种超级细菌，目前临床针对CRGNB的分离效率提升，但是这种细菌对碳青霉烯类广谱抗生素有着非常强的耐药性[2]。这种细菌耐药性不断上升以及快速传播成为当前临床预防和控制CRGNB感染的重要研究课题[3]。本文选取罗定地区作为研究对象，分析临床CRGNB常见碳青霉烯酶基因检测及流行病学，为CRGNB感染预防提供科学临床参考依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株材料的收集

选取罗定地区作为研究对象，收集罗定地区2019年5月至2020年6月临床CRGNB共计150株。主要包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等6种细菌。所有菌株采用法国梅里埃生物科技有限公司生产的微生物检测仪Vitek-2（生产批号为VK2C7499）检测，将分纯后的菌株储存在脱脂牛奶管中，并放置在零下20 ℃的环境中保存。

1.2 实验试剂和仪器

（1）水解酪蛋白培养基干粉：美国BD公司。（2）甘油冻：difco公司。（3）胰蛋白胨：difco公司。（4）酵母提取物：美国BD公司。（5）NaCl（AR）：法国 Bio-Meriuex公司。（6）DNA Marker、PCR 反应链以及Taq酶：法国Bio-Meriuex公司。（7）PCR引物：由上海生工生物工程公司和invitrogen公司合成。（8）主要仪器：PCR在PTC-200型PCR（MJ Reserch）仪上进行。（9）ABI PRISM自动测序仪：美国应用生物系统（ABI）公司，批号3730XL。（10）微生物检测仪Vitek-2：法国梅里埃生物科技有限公司，生产批号为VK2C7499。

1.3 实验方法

1.3.1 改良Hodge实验 先采用无菌生理盐水将大肠埃希菌悬液调至0.5 mcf，按照1∶10稀释，然后将菌液接种在琼脂平板上干燥5～10 min，采用10 μg厄他培南纸片，挑取3～5种待测菌种接种，如果被测菌株与大肠埃希菌抑菌交汇处出现大肠埃希菌生长增强，即产生碳青霉烯酶[4]。

1.3.2 DNA提取 采用煮沸法提取细菌组DNA，将测试菌株接种在中国蓝平板上，在37 ℃环境的培养箱下放置过夜，次日测试单个菌落在中国蓝平板分纯，第3天跳转多个菌落入盛装300 μl的双蒸水EP管中，加热煮沸10 min后，在1.3万rpm离心机下离心3 min，去上清液放在EP管中并置于-20 ℃的环境中保存[5]。

1.3.3 利用聚合酶链反应（PCR检测法） 首先对菌株进行碳青霉烯酶基因和其他β-内酰胺酶基因PCR扩增，扩增的基因包括Ambler A组酶基因，主要包括 blakpc、Blanmc、blasme、blaIMI、blacms；Ambler B 组 酶 基 因 blaIMP、BlaSPM、blaSIM、blaGIM、blaIMI。扩增的其他β-内酰胺酶基因包括AmPC基因，阳性和阴性质控标本跟随每批PCR实验。

1.3.4 PCR产物电泳 37 ℃检测CRGNB的全基因组DNA，PCR产物5 μl上样，1%琼脂糖电泳40 min，电压设置 110 V，0.5 μg/ml EB 染色，在紫外线光照等下看扫描成像。

1.3.5 测序 采用QIAquick离心柱[ABI PRISM自动测序仪[美国应用生物系统（ABI）公司，批号为3730XL]纯化PCR产品，对每个PCR产物均用正反向引物进行双向测序，测序采用双脱氧链末端终止法，在ABI PRISM（ABI公司，生产批号为3730XL）自动测序仪上进行，测序试剂为BigDye terminatorV3.1，对于长片段的测序可以采用步移法设计中间引物，直到测通为止。测序结果分析在Genbank数据中进行[6]。

2 结果

2.1 药敏性结果分析

本实验总计有10株对ETP耐药，耐药率为6.7%；8株对IMP耐药，耐药率为5.3%；6株对MEM耐药，耐药率为4.0%。见表1。

表1 碳青霉烯类抗生素药敏性结果分析

2.2 碳青霉烯酶的表型测试情况

根据碳青霉烯类抗生素药敏性结果，本实验10株在EDTA协同实验中显示阳性结果，EDTA协同实验阳性率6.7%，具体菌种分布见表2。

表2 碳青霉烯酶的表型测试情况

2.3 肠杆菌基因间一致重复序列-聚合酶链（ERICPCR）同源性结果

肺炎克雷伯菌产IMP类型的金属酶有12株，其中有4中克隆类型，KP8-KP17类型有8株是相同的克隆类型金属酶，KP6与KP7二者属于相同的克隆类型金属酶，KP15和KP18两者属于相同克隆类型金属酶，但是KP5是单独的克隆类型金属酶，KP5的产物经过电泳图聚类后显示如图1所示。

肺炎克雷伯菌产KPC类型的金属酶有4株，再扩增后得到的产物经过电泳凝胶成像后，每条带的数量与规格相同，均属于相同的克隆类型，且产物经过电泳图聚类后显示见图2。

阴沟肠杆菌产IMP类型的金属酶有3株，其中E2和E3属于相同克隆类型菌株，E1是其他类型的克隆菌株，其产物经过电泳图聚类后显示见图3。

图1 肺炎克雷伯菌产IMP类型的金属酶克隆类型示意图

图2 肺炎克雷伯菌产KPC类型的金属酶克隆类型示意图

图3 阴沟肠杆菌产IMP类型的金属酶克隆类型示意图

3 讨论

目前国内外在临床细菌感染方面以G-杆菌为主要菌种[7]。根据2005—2018年我国在CHINRT细菌耐药性监测数据报告中指出，中国耐药指标呈现明显下降趋势[8]，住院患者对于抗生素药物的使用率的13个指标中有11个呈现平稳或下降趋势[9]。报告指出在抗菌药物的使用中，2017年碳青霉烯类抗生素药物使用量比2016年呈现上升趋势[10]，但是值得关注的是碳青霉烯类药物的耐药性也呈现上升趋势[11]，且不同地区间碳青霉烯类药物有明显差异[12]，应该重点关注不同地区和不同人群对碳青霉烯类药物的耐药性问题[13]。在报告中列举的所有细菌数量和种类数据中心，G-杆菌占比最高，比例＞70%。此外有文献数据研究指出，大肠埃希菌和克雷伯菌的占比最大，分别位居第一和第二，比例是细菌总数的8%～20%[14]。而碳青霉烯类抗生素对应的细菌谱较广，针对细菌的抑制杀灭活性较强，尤其是对β-内酰胺酶的抗菌稳定性有较明显的优势，对头孢菌素能够产生抗药细菌类型较广，因此能够发挥抵抗治疗的作用[15]。近年来，临床研究着重分析了抗生素使用愈发频繁的问题，尤其是碳青霉烯类抗生素在临床医学中运用的次数越来越多，其中G-杆菌在所有细菌数据和类型中占据比重最多，其次是大肠埃希菌、克雷伯菌、铜绿假单胞菌的CRGNB菌属的比例也呈现逐年上涨的趋势。

本研究选取罗定地区作为研究对象，分析临床CRGNB常见碳青霉烯酶基因检测及流行病学，为CRGNB感染预防提供科学临床参考依据。本实验对ETP耐药率为6.7%，对IMP耐药率为5.3%，对MEM耐药率为4.0%。从碳青霉烯类抗生素药敏性结果对比来看，本实验总计有10株对ETP耐药，其中10株在EDTA协同实验中显示阳性结果，EDTA协同实验阳性率6.7%。肺炎克雷伯菌产IMP类型的金属酶有12株，肺炎克雷伯菌产KPC类型的金属酶有4株，阴沟肠杆菌产IMP类型的金属酶有3株，三种菌种均出现了多种克隆型。由此可见大部分均为对碳青霉烯类抗生素、药物产生耐药性最为明显。

综上所述，CRGNB常见的常见碳青霉烯酶基因以IMP类型为主，KPC类型排名第二，没有发现其他的新基因亚型。在碳青霉烯菌株产生过程中会出现多种克隆细菌类型，这个问题需要医院着重关注，并开展有效的掌控耐药菌株的克隆式传播。