一株特丁津降解菌(短小芽孢杆菌TDJ-ZJ03)的分离

彭邦良

(宁波至诚学校，浙江 宁波 315033)

1 引言

特丁津是一种重要的s-三嗪类除草剂，主要用于玉米、高粱和豆类等作物生产过程中落叶和阔叶杂草的防治。长期且广泛的使用特丁津已经导致其在土壤中有很高水平的残留，并容易通过雨水径流和渗漏进一步造成水体污染[1]。此外，特丁津已被确定为一种内分泌干扰物，它也不易于降解且对微生物有毒性。因此，将特丁津从污染场所中快速清除对于环境安全至关重要[2]。

近年来，已有利用微生物修复受特丁津污染的土壤的成功案例，微生物修复技术因其低成本和环境友好性已成为环境修复领域的开发热点[3]。然而，微生物修复方法需要获得高效的纯菌株或菌群，并有成熟的应用方法；此外，许多因素通常会影响特丁津的生物降解，如温度、pH值以及周围基质的含氧量等[4]。因此，除了筛选高效降解菌株或菌群外，还应关注各种环境因素对特丁津生物降解的影响。本研究从土壤中分离到一株能高效降解特丁津的菌株，并对其降解潜力及在环境保护中的应用进行了研究。

2 材料和方法

2.1 化学试剂与培养基

化学试剂：特丁津(99.1%)购自Sigma-Aldrich公司；所使用的其他化学试剂均为分析纯级。

培养基：①无机盐培养基：七水硫酸镁 0.2 g，硫酸铵 0.1 g，磷酸氢二钾0.1 g，硫酸钙 0.05 g，七水硫酸亚铁 0.01 g，蒸馏水1.0L，pH值7.0。②分离培养基：以含有特丁津的无机盐培养基(特丁津浓度为50 mg/L)作为分离培养基，用于分离特丁津降解菌。③富集培养基：蛋白胨7.0 g，酵母膏5.5 g，牛肉膏粉4.0 g，氯化钠5 g，水1.0L，pH值7.0。

2.2 特丁津降解菌的分离与鉴定

土壤样品取自宁波市农田，取样农田有特丁津应用史。将5.0 g土壤样品溶入到100 mL分离培养基中，在30 ℃下振荡培养(100 rpm)，每隔12 h测定特丁津浓度。若测得的3天降解效率>70%，则将5 mL培养液转移到含有相同浓度特丁津的富集培养基中，连续转移培养5次以上。再次确认降解能力后，将上述富集培养基涂布在含特丁津的无机盐培养平板上，在30 ℃下倒置培养，挑选生长旺盛的菌落，在培养平板上反复划线，得到纯培养物。应用16S rRNA基因序列分析方法对新分离菌株进行菌种鉴定(测序及其相关工作由上海生工公司完成)。

2.3 菌株TDJ-ZJ03对特丁津的降解

将菌株菌株TDJ-ZJ03接种到富集培养基中，在35 ℃下振荡培养(100 r/min)。隔夜培养后通过离心收集细菌菌体，用无菌生理盐水淋洗后进行重悬，浓度约为5×105个/mL；此细菌悬液将作为后续实验的接种体。将6 mL的菌株TDJ-ZJ03接种体接种到150 mL含有特丁津的无机盐培养基中(培养基中特丁津浓度为50 mg/L)，然后振荡培养(100 r/min，35 ℃)。每隔12 h测定特丁津的浓度。

2.4 温度对菌株TDJ-ZJ03生长的影响

将6 mL的菌株TDJ-ZJ03接种体接种到150 mL含有特丁津的无机盐培养基中(特丁津浓度为50 mg/L)，分别置于不同温度下培养，每间隔12h测定OD600。

2.5 pH值对菌株TDJ-ZJ03生长的影响

将含有特丁津的无机盐培养基(特丁津浓度为50 mg/L)的pH值调至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。然后，在不同pH值的培养基中接种菌株TDJ-ZJ03；在35 ℃下培养，定时测定OD600。

2.6 菌株TDJ-ZJ03对特丁津的耐受性

在无机盐培养基中添加特丁津，将特丁津的浓度分别调整为25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和500 mg/L，接种菌株TDJ-ZJ03后在35 ℃下振荡培养， 并定时测定OD600，用以评价菌株TDJ-ZJ03对特丁津的耐受性。

2.7 菌株TDJ-ZJ03对土壤中特丁津的降解

取农场新鲜土壤，分为4组：①灭菌土壤(121 ℃灭菌30 min)；②新鲜土壤；③灭菌土壤中添加TDJ-ZJ03：每100 g灭菌土样中加入8 mL接种液；④ 新鲜土壤中添加TDJ-ZJ03：每100 g新鲜土壤样品中添加8 mL接种液。将无菌特丁津加入各组后(特丁津最终浓度为50 mg/kg)，将样品置于35 ℃下孵育。在此过程中，土壤含水量控制在40%左右(v/v)，并定时测定土壤中特丁津的浓度。

3 结果与讨论

3.1 一株特丁津降解菌的特征描述以及菌株TDJ-ZJ03对特丁津的降解

从土壤中分离到一株能以特丁津为唯一碳源和能源的细菌，命名为TDJ-ZJ03。菌株TDJ-ZJ03为杆菌，大小0.4～0.5μm×1.5～2.0μm，革兰氏阳性，有芽孢，运动型，兼性好氧，在营养肉汤平板上形成不透明的灰白色菌落。氧化酶和过氧化氢酶试验呈阳性，而硝酸盐还原、葡萄糖发酵、尿素酶和淀粉酶试验呈阴性。依据16S rRNA序列分析，菌株TDJ-ZJ03被鉴定为短小芽孢杆菌(16S序列分析委托上海生工生物工程公司完成，GenBank登录号MW131454)。图1中的结果表明:菌株TDJ-ZJ03可以快速降解特丁津；菌株TDJ-ZJ03对特丁津(50 mg/L)的3 d降解率达到约84.6%。

3.2 温度和pH值对菌株TDJ-ZJ03的影响

在35℃时，菌株TDJ-ZJ03的生长水平最高，其次是40 ℃，温度过高或过低都会抑制菌株TDJ-ZJ03的生长(图2)。在30 ℃时，菌株TDJ-ZJ03的生长略有下降，但仍处于较高水平。25 ℃或45 ℃时对菌株TDJ-ZJ03的生长影响较大，但也不会导致其生长停止。一般来说，温度能直接影响微生物的生长和降解酶的活性；在适宜的温度下，微生物能更有效地降解污染物。 基于以上实验结果，认为35～40 ℃是菌株TDJ-ZJ03生长的适宜温度。

图2 温度对菌株TDJ-ZJ03生长的影响

环境pH值也是影响微生物生长的重要因素，图3的实验结果表明：菌株TDJ-ZJ03在pH值7.0～7.5下的生长状况优于在其他pH值条件下。因此，认为菌株TDJ-ZJ03生长和降解特丁津的适宜pH值为7.0～7.5。一般而言，pH值不仅通过影响微生物生长而引起生物降解能力的变化，而且能直接影响相关降解酶的活性[5]。此外，pH值还与一些降解酶基因的表达密切相关。

图3 pH值对菌株TDJ-ZJ03生长的影响

3.3 菌株TDJ-ZJ03对特丁津的耐受性

随着特丁津浓度从25 mg/L增加到100 mg/L，菌株TDJ-ZJ03的OD600逐渐增加。但当特丁津浓度增加到200 mg/L时，菌株TDJ-ZJ03的生长量较100 mg/L时有少许降低；如进一步增加到500 mg/L，其生长则受到了显著的抑制，但并不会导致生长停止(图4)。菌株TDJ-ZJ03的OD600在特丁津浓度为25 mg/L或50 mg/L时会较浓度为100 mg/L时低，这可能是因为25 mg/L(或50 mg/L)的特丁津不能满足菌株TDJ-ZJ03生长所需的碳源或能量需求。因此，初步认为菌株TDJ-ZJ03在实验条件下至少能耐受浓度为500 mg/L的特丁津。根据现有的研究结果，推测菌株TDJ-ZJ03对特丁津有很强的降解能力，有望用于降解较宽浓度范围内的特丁津。

图4 不同浓度的特丁津对菌株TDJ-ZJ03生长的影响

3.4 特丁津在土壤中的降解

图5中的试验数据表明，添加菌株TDJ-ZJ03到土壤中用以加速特丁津的降解是可行的。将菌株TDJ-ZJ03添加到土壤中，能显著提高土壤中特丁津的降解效率；在新鲜土壤或灭菌土壤中添加菌株TDJ-ZJ03后，特丁津(50 mg/kg)在5 d内的降解率能分别达到98.4%和94.4%。而在未添加菌株TDJ-ZJ03的土壤中，新鲜土壤和灭菌土壤在5 d内的降解率分别仅为31.6%和4.8%。因此，也可认为菌株TDJ-ZJ03在土壤中具有良好的生存和繁殖能力，并能有效发挥降解特丁津的功能。另外，图5的数据还表明，新鲜土壤中特丁津的降解效率高于灭菌土壤中的降解效率，这可能是因为新鲜土壤中的某些天然微生物参与了特丁津的降解或对降解起到了一些辅助作用[6]。

图5 在不同处理的土壤中特丁津的降解曲线

4 结语

从土壤中分离得到的短小芽孢杆菌TDJ-ZJ03能高效降解特丁津，在培养基中对特丁津(50 mg/L)的3 d降解率约为84.6%。菌株TDJ-ZJ03生长的最适pH值为7.0～7.5、适宜温度为35～40 ℃；另外，菌株TDJ-ZJ03对特丁津也有很高的耐受性，至少能够耐受浓度为500 mg/L的特丁津。将菌株TDJ-ZJ03施用于土壤中能有效促进特丁津的降解，推断菌株TDJ-ZJ03可用于特丁津污染的治理。