奶牛胎盘还原性多肽不同蛋白酶酶解方法建立与优化

沈留红，张 钺，尤留超，朱颍琨，石 湉，董 可，曹随忠*

（1.四川农业大学动物医学院，成都 611130；2.成都市动物疫病预防控制中心，成都 610041；3.四川育强本草生物技术有限公司，成都 611130）

胎盘组织含有多肽、激素、免疫球蛋白、环肽、甾体和氨基酸等生物活性成分[1-2]，具有抗氧化、抗疲劳和促免疫等作用[3-4]。中医将其蒸煮干燥并碾碎入药，近年来学者通过改变蒸煮条件和优化炮制工艺等方式有效提高胎盘制品生物学活性和总物质含量[5]，但难以获取成分种类单一胎盘制剂。因此，胎盘多肽成为目前胎盘活性成分研究热点之一。研究表明，多种动物胎盘均具有以酶解法制备生物活性多肽潜力[6]，可获取成分种类单一、作用方式确定胎盘多肽，提高胎盘制剂生物安全性[7-8]。目前，酶解胎盘制备活性多肽研究主要集中在活性提升，但最高活性酶解条件提取率低[9]，应结合酶解产物活性和提取率综合优化。奶牛胎盘作为分娩副产物，来源广泛，含有多种天然活性多肽[10]，目前尚未见酶解制备多肽及其提取率优化研究。本研究通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽，分析各因素对其还原性多肽提取率和还原力的影响，探究最佳提取条件，并以每克胎盘提取多肽的还原力作为综合提取率，进一步作响应面优化并验证，以期获得具有较高还原活性和提取率奶牛胎盘多肽，为其临床开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采集规模化奶牛场自然分娩脱落健康中国荷斯坦奶牛新鲜胎盘若干，立即使用生理盐水清洗，除去胎盘内残留血液及污物，至胎盘子叶呈粉红色，于-20℃冰柜保存。

1.2 试验试剂和仪器

1.2.1 试验仪器

Varioskan LUX全波长多功能酶标仪、HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器）、LYOQUEST冷冻干燥机（阿自倍尔泰事达）、Sorvall™Legend™XT冷冻离心机、Barnstead™GenPure™Pro超纯水机（赛默飞）。

1.2.2 试验试剂

胃蛋白酶（250 U·mg-1，批号810H021），木瓜蛋白酶（800 U·mg-1，批号621G025），索莱宝生物；磷 酸 二 氢 钾（KH2PO4）、磷 酸 二 氢 钠（NaH2PO4）、三氯乙酸（CCl3COOH）、三氯化铁（FeCl3），铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）、维生素C（Vitamin C，VitC），均为分析纯，成都科隆。

1.3 方法

1.3.1 奶牛胎盘组织预处理

将奶牛胎盘组织切割称量后置于密闭烧杯，37℃水浴复温融化，剪刀初步剪碎，保证其原有分子不因组织匀浆机产热而分解，冰浴下使用组织匀浆机以12 000 r·min-1破碎至无明显组织碎块。

1.3.2 蛋白酶酶解法制备奶牛胎盘多肽

严格按照说明书所述最适条件（木瓜蛋白酶和胃蛋白酶最适温度分别为55和37℃，最适pH分别为6.5和2.5），以1.3.1制备胎盘匀浆作为底物酶解后，沸水浴10 min灭活。将酶解液以6 000 r·min-1离心5 min，收集上清，冷冻干燥24 h，称量冻干粉质量并计算冻干粉质量所占胎盘组织匀浆质量百分比，记为提取率R。以Design Expert 8.0.6软件基于Box-Behenken中心响应法设计响应面试验，选择酶解时间、底物浓度、酶底比3因素为自变量，做3因素3水平共17个试验点，包括5个中心点和12个析因点。参考文献[11-12]设计各因素水平，分别记酶解时间（h）、底物浓度（%）和酶底比（%）为因素A、B和C，酶解时间3、5、7 h；底物浓度为10%、30%、50%；酶底比为1%、3%、5%，分别对应A、B、C因素水平为-1、0、1。

1.3.3 普鲁士蓝法标准曲线建立和奶牛胎盘多肽还原能力测定

使用普鲁士蓝法测定样品还原力，具有还原能力样品可将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O），再以Fe3+形成普鲁士蓝（Fe4[Fe(CN)6]3），由700 nm处吸光度（A700）变化检测还原力。使用不同浓度VitC溶液建立标准曲线，评估样品还原能力。分别将VitC配制成100.00、50.00、25.00、12.50、6.25和3.125μg·mL-1标准溶液；另配制10% CCl3COOH、10% K3[Fe(CN)6]、0.1% FeCl3和pH 6.6磷酸盐缓冲液。向75μL各浓度VitC标准溶液先后加入75μL pH 6.6磷酸缓冲液和1% K3[Fe(CN)6]溶液，充分震荡后50℃水浴20 min，加入10%CCl3COOH 75μL，3 000 r·min-1离心1 min，制得待测液。取200μL待测液于96孔板中，加入0.1%FeCl320μL，测定其A700。以标准溶液VitC浓度为横坐标，A700为纵坐标，使用SPSS 24.0以线性回归方式建立标准曲线。将各组制得胎盘多肽冻干粉使用pH 6.6磷酸盐缓冲液稀释为1 mg·mL-1样液，按照上述方法，测定其A700，将其代入标准曲线以获得样品相当VitC溶液浓度，记为VitC当量（μg·mg-1）。

1.4 数据分析与处理

分别以提取率和还原力为响应值，应用Design expert 8.0.6分析，以酶解时间、底物浓度、酶底比对其提取率和还原力影响建立响应面回归模型，并验证其拟合度和可靠性。

1.5 奶牛胎盘多肽高效提取方法建立和优化

基于响应面模型，分别以最大化提取率和VitC当量优化各提取因素。依照1.4所确定最优化条件作6次平行试验验证响应面模型有效性，对比实际提取率和还原力与响应面预期值。将提取率和还原力作相关性分析，以每克胎盘所提取多肽还原力作为综合提取率E（μg·g-1）。以其为响应值，建立响应面回归模型分析拟合度和可靠性后，以该模型优化奶牛胎盘多肽提取条件，并作6次试验，对比实际综合提取率与响应面预期值。

2 结果与分析

2.1 普鲁士蓝法标准曲线建立

以100、50、25、12.5、6.25和3.125μg·mL-1VitC标准溶液使用普鲁士蓝法测得A700为1.67、0.802、0.367、0.187、0.15和0.097，以VitC浓度为自变量，A700为因变量，建立截距为0.008（SE=0.0025），自变量因数为0.0164（SE=0.001）线性回归模型为A700=0.0164VitC当量+0.008，相关系数R2为99.6%，预测效果可靠，标准曲线见图1。

图1 维生素C的普鲁士蓝法标准曲线Fig.1 Prussian blue standard curve for VitC

2.2 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解法制备奶牛胎盘还原性多肽

木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解法制备奶牛胎盘还原性多肽响应面试验结果如表1所示。A、B和C三因素对提取率和VitC当量存在复杂的相互作用关系。

2.3 不同酶解条件对奶牛胎盘多肽提取率和还原力的影响

分别以提取率和还原力为响应值，由表1得到响应面二次回归方程分别为：木瓜蛋白酶R=6.35+0.59A+0.55B+0.66C-0.15AB+0.55AC-0.25BC-0.51A2-0.61B2-0.27C2；VitC当量=67.42-7.97A-1.09B+5.02C-1.67AB-5.27AC-1.74BC-8.54A2-0.96B2-13.29C2。

胃蛋白酶R=5.83+0.97A+0.29B+0.18C-0.4AB-0.083AC+0.085BC-1.03A2-0.28B2-0.19C2；VitC当量=56.52-3.81A+6.87B+6.37C-0.54AB+10.12AC-2.09BC-6.4A2-10.86B2-8.58C2。

木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽响应面试验结果如表2所示。

表1 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽响应面试验结果Table 1 Response surface results of papain and pepsin hydrolysis of cow's placenta to prepare reducing polypeptide

表2 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽的回归模型方差分析结果Table 2 Regression model analysis of papain and pepsin hydrolyzed placenta preparing reducing polypeptides

由表2可知，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶回归模型均极显著（P＜0.01），失拟项均不显著（P＞0.05），木瓜蛋白酶和胃蛋白酶模型R2分别为96.56%、99.22%和97.54%、97.73%，校正系数R2分别为92.14%、98.21%和94.38%、94.82%，模型拟合度较好；木瓜蛋白酶在提取率模型中，一次项A、B、C和二次项A2、B2均与提取率呈极显著相关（P＜0.01）。对提取率影响因素C＞A＞B；还原力模型中，一次项A、C，二次项A2、C2，交互项AC均与响应值极显著相关（P＜0.01），表明各因素间存在相互影响。对还原力因素A＞C＞B；胃蛋白酶提取率模型中，一次项A、B，二次项A2和交互项AB对提取率影响极显著（P＜0.01），交互项AB对提取率影响显著（P＜0.05），还原力模型中一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2与交互项AC对还原力影响极显著（P＜0.01），表明各因素对提取率影响并非线性关系，存在一定相互作用。提取率影响因素A＞B＞C；对还原力影响因素B＞C＞A。

由图2可见，固定酶底比，提取率随反应时间而上升，但随酶解时间延长，其响应值上升速率逐渐减慢，表示试验水平内底物可完全酶解（见图2a），还原力随酶解时间先上升后下降（见图2d）；固定酶解时间，提取率随底物浓度、酶底比提高而上升，反应时间和酶底比对提取率存在正向相互作用（见图2b、2c），还原力随酶底比先升后降（见图2e）；固定底物浓度，还原力随酶底比提高而上升，且酶底比越高，酶解时间越短，响应值越高（见图2f）。

图2 各因素交互作用对木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盘提取率和还原力的影响Fig.2 Effect of interaction of various factors on the yield and antioxidant activity of papain enzymatically hydrolyzed cows'placenta

固定酶底比，底物浓度对提取率影响小（见图3a），酶解时间对还原力影响小，而随底物浓度上升，相同时间下的还原力升高（见图3d）。固定反应时间，提取率随酶底比先升后降，表明最佳酶底比存在于试验设计范围内（见图3b），酶底比越高，则还原力越高，同时底物浓度与酶底比呈正向相互作用（见图3e）；固定底物浓度，提取率随酶底比提高而上升，且酶底比越高，酶解时间越短，响应值越高（见图3c），可见，反应时间短时，酶底比越高，还原力越低，反应时间长时，酶底比越高，还原力越高（见图3f）。

以最大化提取率和Vitc当量为目标通过Design Expert 8.0.6软件分析，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘理论最佳条件分别为：反应时间6.18、6.22 h，底物浓度34.78%、30.71%，酶底比5.00%、3.18%，此时理论提取率为6.97%、6.14%，反应时间3.95、4.83h，底物浓度22.04%、35.82%，酶底比3.64%、3.57%，此时理论Vitc当量为70.54、58.59μg·mg-1。根据优化结果作6次平行试验验证响应面模型有效性，实际验证试验条件为：反应时间6.18、6.30 h，底物浓度35%、30%，酶底比5.0%、3.0%和反应时间4.0、4.8 h，底物浓度22%、36%，酶底比3.5%、3.5%，实测平均提取率分别为6.80%、6.05%，VitC当量分别为68.72、57.96μg·mg-1，均与理论值接近且重复性较好，说明响应面优化结果可靠。

图3 各因素交互作用对奶牛胎盘胃蛋白酶酶解物提取率和还原力的影响Fig.3 Effect of interaction of various factors on the yield and antioxidant activity of pepsin hydrolysate in dairy cow placenta

2.4 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽方法的优化

使用Pearson相关性检验法对上述各结果分析显示，不同方式提取率与还原力间存在不同相互关系，与木瓜蛋白酶和胃蛋白酶相关性系数分别为0.176（P=0.5）、0.248（P=0.337），即提取率与VitC当量均无明显相关性（P＞0.05）。可见，酶解条件对胎盘多肽还原力影响较大，为同时获取较高提取率与还原力，综合这两指标建立综合提取率E（μg·g-1），以各因素水平和E值为响应值，进一步优化酶解条件。

以综合提取率对木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽响应面分析结果如表3所示。

表3 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽的优化Table 3 Optimization of papain and pepsin enzymatic hydrolysis of fetal placenta to prepare antioxidant active peptide

2.5 以综合提取率为响应值的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备还原性多肽的优化

基于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶制备胎盘还原性多肽响应值建立响应面回归模型，得二次响应面回归方程分别为：E=4284.35-138.73A+228.94B+79.69C-149.21AB-294.33AC-197.49BC-880.4A2-459.82B2-881.19C2和E=3297.34+207.81A+448.33B+447.25C-118.46AB+500.10AC-57.20BC-825.994A2-685.81B2-598.59C2。

如表4所示，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶响应面模型均极显著（P＜0.01）、失拟项均不显著（P＞0.05），模型R2分别为97.66%和97.99%，校正系数R2为94.65%和95.40%，模型描述性均较好。木瓜蛋白酶一次项C、二次项A2、B2、C2均极显著影响响应值（P＜0.01），一次项B、交互项AC显著影响响应值（P＜0.05）。而胃蛋白酶一次项B、C，二次项A2、B2、C2与交互项AC均极显著影响响应值（P＜0.01），一次项A对显著影响响应值（P＜0.05）。可见各因素间存在相互作用。由F值可见，对响应值影响木瓜蛋白酶：C因素＞B因素＞C因素，胃蛋白酶：B因素＞C因素＞A因素。

表4 以综合提取率为响应值的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解胎盘试验回归模型方差分析结果Table 4 Results of variance analysis of papain-enzymed placenta test regression model with comprehensive extraction rate response

固定酶底比，响应值随酶解时间先升后降，且底物浓度越高，响应值越高，但随酶解时间推移，底物浓度导致的响应值差异逐渐减少（见图4a）；固定酶解时间，响应值随酶底比升高而升高，且在酶底比较高时，底物浓度对响应值影响差异减小（见图4b）；固定底物浓度，酶底比与酶解时间提高均使响应值先升后降，且酶底比越高，达到最高响应值时间短，响应值随后下降越快（见图4c）。固定酶底比，响应值随酶解时间先升后降，且底物浓度越高，同一时间响应值越高，但底物浓度对响应值变化趋势无明显影响（见图5a）；固定酶解时间，响应值随底物浓度先升后降，且酶底比越高，在相同底物浓度时响应值越高（见图5b）；固定底物浓度，酶解时间短时，响应值随酶底比升高先升后降，而酶解时间长时，响应值随酶底比升高而升高（见图5c）。

图4 各因素交互作用对奶牛胎盘木瓜蛋白酶提取物综合提取率的影响Fig.4 Effect of interaction of various factors on the comprehensive extraction rate of papain extract from dairy cow placenta

图5 各因素交互作用对奶牛胎盘胃蛋白酶提取物综合提取率的影响Fig.5 Effect of interaction of various factors on the comprehensive extraction rate of pepsin extract from dairy cow placenta

以最大化综合提取率为目标通过Design Expert 8.0.6软件分析，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘理论最佳条件为：反应时间4.70、5.49 h，底物浓度34.03%、35.74%，酶底比3.66%、3.92%，此时理论综合提取率为4 414.09、3 490.41μg·g-1。根据优化结果作6次平行试验验证响应面模型有效性，实际验证试验条件为：反应时间4.5、5.5 h，底物浓度34%、56%，酶底比3.6%、4.0%，实测平均综合提取率为4 397.32和3 466.32μg·g-1，与理论值接近且重复性较好，说明响应面优化结果可靠。

3 讨论与结论

3.1 不同木瓜蛋白酶酶解条件对奶牛胎盘还原性多肽制备的影响

木瓜蛋白酶由番木瓜（Carica papaya）果皮中提取，广泛用于食品工业生产和性质改良（如肉质嫩化、短肽提取和啤酒工业等）[13]，还可酶解动植物组织以获取具有抗氧化、降血压和促进免疫等生物学活性多肽[14-15]。本试验严格按说明书最佳pH

6.5作酶解反应，但基于底物物化性质，在酶解过程中反应体系最佳起始pH出现差异[16]，制备植物源性多肽时，最佳起始酶解pH常偏酸性[17]，而酶解动物组织效果最佳pH常为中性或碱性[16]，推测其较为广泛酶切能力使反应体系中非蛋白成分参与水解，造成pH变化，这可能是本试验所制备胎盘多肽还原力受酶底比、酶解时间及其相互作用影响均显著的原因。本试验建立提取率最高条件为反应时间6.18 h，底物浓度34.78%，酶底比5.00%，此时理论提取率为6.97%，优于王君旸对羊胎盘的提取率[18]；还原力最高条件为反应时间3.95 h，底物浓度22.04%，酶底比3.64%，此时理论VitC当量为70.54μg·mg-1，优于师玉淼等提取猪胎盘多肽还原力[19]；同时理论提取率和VitC当量均优于超声破碎和胰蛋白酶酶解法提取结果[20]；此外，最高提取率和还原力所需酶解条件差异较大，且相同条件下胎盘多肽提取率与还原活性无显著相关性，与向泽敏等结果一致[9]，表明蛋白酶对组织蛋白酶解是一个动态过程，具有生物活性的多肽若仍具有蛋白酶酶切位点则被进一步酶解，使其失去原有活性[21]。

3.2 不同胃蛋白酶酶解条件对奶牛胎盘组织还原性多肽制备的影响

胃蛋白酶是机体重要消化酶，常被用于模拟胃内消化环境和提取多种生物源性多肽。因最适pH较极端，常导致蛋白质变性，暴露内部基团，获得较高酶解产物提取率[22]，还可将无生物活性组织蛋白酶解成具有一定生物活性肽段，包括抗氧化多肽[23-24]。本试验反应时间6.22 h，底物浓度30.71%，酶底比3.18%时获得最高理论提取率6.14%；反应时间4.83 h，底物浓度35.82%，酶底比3.57%时获得最高理论VitC当量58.59μg·mg-1，提取率和最高VitC当量均优于超声破碎和胰蛋白酶，与师玉淼等[19]结果一致，表明不同动物胎盘均能被胃蛋白酶酶解为具有抗氧化能力的多肽；同时，本试验酶底比对提取率影响不显著，而底物浓度影响显著，可能因胃蛋白酶对奶牛胎盘蛋白酶解过程中米氏常数较高[25]，使底物浓度限制酶解速度，高底物浓度可明显提升反应速率，相同时间内产生可溶性多肽增加。此外，奶牛胎盘多肽抗氧化能力受各种因素影响均极显著，且与提取率无显著相关，说明奶牛胎盘酶解是多底物酶解反应，由于对不同底物亲和力不同，底物浓度变化显著影响酶解进程[26]，本试验中表现为固定酶底比下，底物浓度越高，相同酶解时间下产生的抗氧化多肽浓度越高，抗氧化能力随酶解时间延长先升后降；而随酶底比提升，酶解体系中抗氧化多肽含量达到峰值所需时间越短，抗氧化能力下降也随之加快。

3.3 不同酶解条件对奶牛胎盘还原性多肽综合提取率的影响

蛋白酶解产物活性受温度、pH、底物浓度、酶底比和酶解时间等众多因素影响，规律复杂，为获取较高活性和提取率多肽，需优化酶解条件。本研究结果表明，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盘制备抗还原性多肽最优条件为反应时间4.7 h，底物浓度34.03%，酶底比3.66%和反应时间5.49 h，底物浓度35.74%，酶底比3.92%，综合提取率分别为4 414.09和3 490.41μg·g-1，此时胎盘多肽提取率和还原力仍高于或接近师玉淼和王君旸等提取结果[8,18]。以综合提取率作为响应值优化可较好平衡各因素对提取率和还原性的影响，在保证提取率前提下获得较高活性奶牛胎盘多肽。高底物浓度在固定酶底比下降低酶解产物对胎盘蛋白竞争性抑制作用，产生更多活性多肽，从而提高相同酶解时间内综合提取率[9,29]；酶解时间固定时，酶底比对底物浓度与响应值相关性影响较大，证明较高酶底比可加快酶解反应速率，进一步酶解还原性多肽，降低还原力[28]；底物浓度固定，酶解时间短时，综合提取率随酶底比降低，但随酶解时间延长，低酶底下综合提取率上升，而高酶底比下则先升后降，说明酶底比在一定程度上决定同一时间下的酶解速率，决定提取率与还原能力，影响综合提取率[21]。