中国儿童急性淋巴细胞白血病GATA3基因单核苷酸多态性与预后的相关性研究

陈潇潇， 王 翔， 李本尚， 胡文婷， 陈长城， 沈树红， 陈 静， 薛惠良， 汤静燕， 汤燕静

在B细胞型急性淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患儿中，约有15%遗传表达特征与费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)相似，称之为Ph样ALL，且Ph样ALL的患儿往往有较高的复发率。这类亚型的ALL在淋巴细胞发育活化、细胞因子受体、激酶信号传导路径等方面都有遗传结构改变，特别与体细胞IKZF1基因的缺失或突变密切相关，往往伴有CRLF2基因重排和JAK2突变[1～5]。研究[6]表明，转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)是参与调节Th2细胞分化的一个重要因子，在造血干细胞和淋巴细胞早期发育阶段发挥着重要作用。St. Jude儿童研究医院的Yang等研究显示，GATA3基因的SNP位点rs3824662与Ph样ALL高风险相关，其纯合子基因型A/A的患儿早期治疗反应不良且复发率高。研究同时指出，A/A基因型患儿发生体细胞JAK突变、CRLF2重排和IKZF1缺失的风险明显高于C/C基因型和A/C杂合型，因此，GATA3的遗传性变异与Ph样ALL及其不良预后有关[7，8]。A/A基因型常见于西班牙裔美国人以及其他高印第安人血统的个体中，Migliorini[9]和Walsh[10]等相继报道了rs3824662 A/A基因型在欧洲西班牙裔ALL中的不良预后，而一组来自埃及的研究[11]也得出了相似的结果，但是罕见中国汉族儿童的相关报道。我们通过TaqMan探针荧光定量PCR法检测入组SCMC-ALL-2005修正方案的患儿GATA3基因rs3781093和rs3824662两个SNP位点，并统计分析其与ALL早期治疗反应、复发率与预后之间的关系，探讨SNP位点不同基因型对ALL疗效、预后的影响。

1 资料与方法

1.1资料来源 选取2009-05～2014-12在上海儿童医学中心明确诊断并接受治疗的678例ALL患儿。患儿分别来自上海、浙江、江苏、安徽、福建、江西等省份，均为汉族。入选标准：初诊病例，未经过任何相关治疗；就诊时年龄≤18岁；符合ALL诊断标准[12]；家长或监护人同意患儿接受SCMC-ALL-2005修正方案治疗，并签署知情同意书；愿意接受长期随访；除外成熟B-ALL。标本来源于患儿疾病缓解期的骨髓单个核细胞，抽提基因组DNA。本研究通过本中心伦理委员会批准(上海儿童医学中心急性淋巴细胞白血病2005 & 2009方案，伦理批号：SCMCIRB-J201400)。

1.2分组标准与治疗方案 SCMC-ALL-2005修正方案分组标准、治疗方案和流程见本中心既往发表文章[13]。

1.3治疗反应和分子生物学预后相关因素检测 所有初发患儿肿瘤细胞完善下列相关分子生物学检测：real-time PCR检测t(4；11)、t(9；22)、t(1；19)、t(12；21)融合基因，荧光原位免疫杂交法(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测断裂点簇集区/Abelson白血病病毒(breakpoint cluster region-Abelson gene，BCR/ABL)融合基因、混合系白血病基因(mixed lineage leukemia，MLL)。所有患儿在诱导缓解第35天完善骨髓细胞形态学和流式细胞术监测MRD作为早期治疗反应评估[14]。

1.4方法 收集入组儿童缓解期骨髓样本，分离单个核细胞，采用DNA提取试剂盒(QIAGEN)抽提基因组DNA。TaqMan® MGB probes,FAMTMand VIC® dye labeled探针购自ABI公司(Catalog Number 4351379)，按照下列表1配置5 μl体系，在ABI PRISM 7900HT仪器内设置反应条件：95 ℃预变性10 min，92 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40个循环。利用Sanger测序验证TaqMan探针法检测结果：2个SNPs位点的3种不同基因型，每种基因型各取10份基因组DNA(引物序列rs3781093：5′-TTCCTGTGCTCTGTTCCTT；rs3824662：5′-TATCACCCTCCCCACCA)送上海生工生物工程技术服务有限公司进行Sanger单向测序。

表1 TaqMan探针荧光定量PCR反应体系

1.5统计学方法 应用SPSS22.0统计软件方差分析计算等位基因频率分布Hardy-Weinberg平衡定律;运用SHEsis程序(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)计算2个SNPs(rs3781093、rs3824662)之间的连锁不平衡程度，即Lewontin系数(D′)和相关系数的平方(r2)。治疗中患儿与医务人员失去联系>6个月定义为失访，失访者以失访时疾病状态统计。无复发生存(relapse-free survival，RFS)从治疗起始日计算，统计终点为复发。未失访者其随访日期截至2020-07-01。应用SPSS22.0统计软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验；RFS估计采用Kaplan-Meier生存分析法、log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般资料 入组SCMC-ALL-2005修正方案并可获取样本和临床资料的患儿共678例，其中男性411例，女性267例；中位年龄4.86岁(0.25～16.65岁)。所有患者随访至2020-07-01，中位随访时间为76个月(1.2～126个月)。

2.2TaqMan探针PCR方法检测结果 见图1。

本图为部分样本rs3781093检测结果，蓝点为FAM荧光即T/T基因型，红色为VIC荧光即C/C基因型，绿色为T/C杂合型，黑色×为空白对照。

2.3Sanger测序验证TaqMan探针PCR法结果 60份标本测序结果与TaqMan探针法一致。见图2。

ⓐ为C/C型；ⓑ为T/T型；ⓒ为T/C杂合型

2.4GATA3 SNP位点rs3781093和rs3824662检测结果 678份样本中，检测到rs3781093位点基因型T/T共263例，基因型T/C共305例，基因型C/C共110例，C位点的等位基因频率为38.8%(χ2=1.834，P=0.175)。按照Hardy-Weinberg平衡定律，符合Hardy-Weinbery遗传平衡法则(P>0.05)，说明本组能代表一般中国汉族人群。rs3824662位点的检测中，基因型A/A共106例，基因型A/C共308例，基因型C/C共264例，A位点的等位基因频率为38.3%(χ2=1.046，P=0.307)，提示群体基因遗传平衡，样本来自同一蒙德尔群体。两个SNPs位于10号染色体GATA3基因内含子区域，通过SHEsis程序进行连锁不平衡分析，D′和r2分别为0.991和0.965，表明这两个SNPs之间存在高度连锁不平衡性。见图3。

图3 rs3781093和rs3824662连锁不平衡分析图

2.5rs3781093和rs3824662 SNP与预后的关系 678例患者中，共有158例复发，中位复发时间为24.1个月。在rs3781093位点，各基因型复发数分别为T/T型55例，T/C型73例，C/C型30例。见表2。T/T基因型患儿的5年RFS为(77.6±2.7)%，T/C基因型为(75.6±2.6)%，C/C基因型为(69.2±4.8)%，三者间差异无统计学意义(χ2=2.577，P=0.276)。见图4。在rs3824662位点，各基因型复发数分别为A/A型29例，A/C型74例，C/C型55例。见表2。C/C基因型患儿的5年RFS为(77.7±2.7)%，A/C基因型为(74.9±2.5)%，A/A基因型为(69.1±4.9)%，三者间差异无统计学意义(χ2=2.773，P=0.250)。见图4。

图4 rs3781093及rs3824662不同基因型无复发生存率图

2.6rs3781093和rs3824662 SNP与治疗早期反应的关系 本研究取诱导第35天MRD为评估治疗早期反应时间点，其中629例患儿有流式细胞术或融合基因的MRD标记，分析显示如下：629例患儿中，rs3781093位点T/T基因型242例，MRD≥0.01%有81例(33.5%)；T/C基因型291例，MRD≥0.01%有118例(40.5%)；C/C基因型96例，MRD≥0.01%有46例(47.9%)。C/C基因型患儿D35-MRD阳性率高于其他两种基因型患儿(χ2=6.614，P=0.037)。在rs3824662位点，A/A基因型患儿D35-MRD阳性率高于其他两种基因型患儿，差异有统计学意义(χ2=7.581，P=0.023)。见表2。

2.7rs3781093和rs3824662 SNP在细胞亚型及各危险度分组中的分布 678例患儿中，两SNP位点各基因型在B-ALL和T细胞型ALL(T-ALL)中的分布均相似(rs3781093，χ2=0.410，P=0.815；rs3824662，χ2=0.430，P=0.807)。678例患者中，低危组235例，中危组157例，高危组240例，超高危组46例。rs3781093位点C/C基因型相对在中高危组中分布更多，但组间差异无统计学意义(χ2=11.092，P=0.086)。在rs3824662位点结果也是类似的，A/A基因型相对在中高危组中分布更多，但组间差异无统计学意义(χ2=12.214，P=0.057)。见表2。

表2 678例ALL患儿SNP rs3781093和rs3824662各基因型与疾病分组、治疗反应和复发的关系[n(%)]

3 讨论

3.1与Ph阳性ALL类似，Ph样ALL是一组具有高度遗传学异质性的疾病，且单纯传统化疗治疗复发率高，早期筛选出该亚型ALL患儿并给予相应强度的化疗和靶向治疗方案很重要[15]。除了筛查Ph样ALL相关的基因如IKZF1、PAX5、JAK2、ABL和JAK激酶通路的融合基因等，美国St. Jude儿童研究医院和欧洲及埃及部分协作组发现GATA3的两个SNP位点rs3781093和rs3824662与Ph样ALL相关，其中rs3824662的纯合子基因型A/A的患儿早期治疗反应不佳且复发率高。

3.2GATA3是GATA转录因子家族中的一员，是血小板生成早期阶段的必要因子。GATA3既与T淋巴细胞系分化密切相关，如在促进Th2细胞分化的同时抑制Th1细胞的分化[16]，也与B细胞发育相关，抑制GATA3转录对早期B细胞定向分化是必要的[17]。GATA有一个类固醇激素受体超家族C4锌指结构的DNA结合基序，GATA3不仅可以直接结合至相应DNA序列来调节靶基因的表达，还可通过染色质重塑来改变基因的遗传性状。IKZF1基因编码的锌指结构蛋白IKAROS(IK)是重要的造血转录调控因子，GATA3在淋巴细胞中与IK相互作用，辅助IK调节造血细胞特异基因的转录，是造血细胞基因表达调控的重要机制。IK的显性负异构体(IK4和IK6)在恶性造血细胞中经常过表达，且与GATA相互作用的效率较IK低，这可能会破坏IK-GATA因子相互作用从而导致细胞的恶性转化。

3.3rs3781093和rs3824662的SNP都位于10号染色体的GATA3基因内含子上(hg18：8141933，8144214)，等位基因型分别为C/T和A/C。因为宿主遗传多态性具有种族差异，既往国外的研究报道涉及亚洲人种尤其中国汉族儿童罕见，本中心SCMC-ALL-2005修正方案入组了近700例ALL病例，可获得的基因组DNA有678例，样本量较大。国外研究报道，欧洲、拉丁裔和亚洲人群的这两个SNPs有强烈连锁不平衡性，而非洲裔人群则显示两者不相关。本研究结果也显示患儿的rs3781093和rs3824662有强烈的连锁不平衡性(D′=0.991,r2=0.965)，故以下分析讨论皆以rs3824662为例。但是我们对中国汉族儿童ALL的研究结果与Yang及Gabriele等学者研究的结果[9]并不一致。与Ph样ALL高度相关的SNP rs3824662的A/A基因型复发率并不高于C/C型和A/C杂合型；与ALL患儿的无复发生存率也无相关性，5年RFS相对偏低但差异无统计学意义(P>0.05)。同样值得关注的是，按照SCMC-ALL-2005修正方案的危险度分组方法，本研究中分布于中、高危组的A/A基因型患儿相对高于其他两种基因型；并且诱导治疗第35天MRD阳性率也显著高于A/C型和C/C型。Zhang等[18]的研究也提示rs3824662与ALL诱导缓解期治疗反应相关。我们考虑出现这种结果与本方案将第35天MRD检测结果作为危险度分组依据有关。多组大宗研究显示，儿童ALL治疗过程中任何时间点MRD≥0.01%患者的复发风险较高；诱导缓解化疗结束时的MRD阳性常提示预后不良。因此同许多协作组一样，SCMC-ALL-2005修正方案将诱导化疗结束时MRD是否转阴作为危险度分组的主要参考因素之一，并由此决定后续化疗的强度。美国St.Jude儿童研究医院的一项回顾性研究显示，Ph样ALL儿童不良预后可以在基于诱导缓解治疗中和治疗末MRD水平的危险度分组分层治疗下逆转。St. Jude XV方案危险度分组依据与SCMC-ALL-2005修正方案相似，将诱导治疗第19天和诱导结束的MRD水平作为分组依据，而结果表明Ph样ALL在这两个治疗时间点的MRD明显高于非Ph样ALL组，因此这部分患儿被纳入更高危险度组接受更强烈的化疗，并且远期治疗效果并不差[19]。本研究虽然没有检测IKZF1、PAX5和JAK2等基因畸变及ABL和JAK激酶通路的相关融合基因，定义Ph样ALL并将其作为分组依据，但是在初诊时危险度分组的基础上将诱导治疗第35天时MRD≥0.01%的病例升入更高一级的危险度组，接受相对更强的化疗，因此，本研究中rs3824662位点的A/A基因型的无复发生存率与远期疗效并不劣于A/C基因型和C/C基因型可能与此密切相关。

综上所述，中国ALL患儿的GATA3基因rs3781093和rs3824662位点间存在高度连锁不平衡，rs3781093位点的C/C基因型和rs3824662位点的A/A基因型与早期治疗反应不佳相关，但未显著影响远期无复发生存率，这可能与治疗方案中依据诱导缓解结束后MRD水平相应强化治疗有关。