一测多评法同时测定辛夷配方颗粒中4 种成分

智雪枝，张 博，田 兰，刘惠军，陈 睿

（上海市松江食品药品检验所，上海 201600）

辛夷是木兰科植物望春花Magnolia biondii Pamp.、玉兰Magnolia denudate Desr.或武当玉兰Magnolia sprengeri Pamp.的干燥花蕾，具有散风寒、通鼻窍之功效，用于风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊［1］，其主要化学成分为挥发油、木脂素、生物碱［2-4］，其中木脂素具有抗炎免疫、降压、影响中枢神经系统、抗菌、抗病毒、抗衰老、杀虫、抗真菌等作用［5-7］。由于单一有效成分或指标成分的定量分析模式已不能满足中药现代化对于质量控制的要求，故曹纬国等［8］建立HPLC 法测定辛夷中辛夷脂素、木兰脂素的含量，赵鑫等［9］采用HPLC-MS法结合一测多评对辛夷提取物中4 种木脂素含量进行测定，可较好地解决中药对照品不易获得，从而对多成分含量测定造成一定局限性的难题。

中药配方颗粒具有药性强、药效好、免煎煮、服用方便等优势，临床应用广泛［10］。本实验建立一测多评法同时测定辛夷配方颗粒中松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A、辛夷脂素的含量，以期为该制剂质量的有效控制及后续研究提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Waters Acquity Arc 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；KQ5200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CPA225D 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］。

1.2 试剂与药物 松脂素二甲醚（18032722，纯度99.0%）、表木兰脂素A（18120328，纯度98.14%）对照品均购于上海同田生物技术股份有限公司；木兰脂素（110882-201607，纯度98.4%）、辛夷脂素（111561-200201，纯度100%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。辛夷配方颗粒（厂家 A，批号 1612001W、1701001W、1807001W；厂家B，批号18 091131；厂家C，批号7 120412；厂家D，批号A1802324）。甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件 Waters SunFire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（含0.1%磷酸，B），梯度洗脱（0～20 min，10%～70% A；20～30 min，70%～90%A；30～32 min，90%A）；体积流量0.8 mL／min；柱温35 ℃；检测波长232 nm（辛夷脂素）、278 nm（松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A）；进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A、辛夷脂素对照品适量，用50%甲醇制备成贮备液（四者质量浓度分别为0.506 880、0.588 432、0.487 756、0.053 950 mg／mL），用于线性关系考察。另分别精密称取4 种对照品7.48、10.08、10.06、10.79 mg，置于20、20、20、200 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，各吸取1.0 mL 至25 mL 量瓶中，50% 甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，用于加样回收率试验。

2.2.2 线性溶液 精密吸取“2.2.1”项下贮备液适量，50%甲醇依次稀释至200、100、50、20、10、20／3、5 倍，即得，编号1～7。

2.2.3 供试品溶液 取颗粒适量，研细，精密称取0.5 g，置于25 mL 量瓶中，加50% 甲醇约20 mL，超声处理30 min，放冷，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液 按处方比例制备缺辛夷的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，色谱图基线平稳，各成分色谱峰与其他杂质峰均能得到有效分离，分离度大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下线性溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下线性溶液1、4、7，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A、辛夷脂素峰面积RSD 分别为0.3%、0.4%、0.7%、0.8%（线性溶液1），0.3%、0.3%、0.5%、0.6%（线性溶液4），0.2%、0.2%、0.5%、0.3%（线性溶液7），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取同一批颗粒6 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A、辛夷脂素含量RSD 分别为1.2%、1.1%、1.3%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A、辛夷脂素含量RSD 分别为0.3%、0.4%、0.6%、0.5%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的颗粒0.5 g，置于25 mL 量瓶中，平行9 份，每3份为1 组，按50%、100%、150%水平精密加入对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.9 相对校正因子测定 精密吸取“2.2.2”项下线性溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以木兰脂素为内标，计算其他3 种成分的相对校正因子fk／s，公式为fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表3。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

表3 各成分相对校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.10 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响 本实验比较了Waters Acquity Arc、Agilent 1260 色谱仪，以及Kromasil（4.6 mm× 250 mm，5 μm）、Merck RP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜3%）。

表4 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.11 不同柱温对相对校正因子的影响 本实验采用Agilent 1260 色谱仪、Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱考察柱温25、30、35、40、45、50 ℃对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜3%）。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.12 不同体积流量对相对校正因子的影响 本实验采用Agilent 1260 色谱仪、Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱考察体积流量0.7、0.8、0.9 mL／min 对相对校正因子的影响，结果见表6，可知均无明显影响（RSD＜3%）。

表6 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.13 色谱峰定位 以木兰脂素为内标，计算在“2.10”项仪器、色谱柱下其他3 种成分的相对保留时间，结果见表7，可知均无明显影响（RSD＜3%）。

表7 各成分相对保留时间Tab.7 Relative retention time of various constituents

2.14 样品含有量测定 取6 批颗粒，每批3 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表8。由此可知，2 种方法所得结果接近，相对平均偏差（RAD）＜2.25%。

表8 各成分含量测定结果（μg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 讨论

3.1 流动相筛选 本实验考察了甲醇-水［8-9］、乙腈-水［11］、甲醇-水（含0.1% 甲酸）［12］、甲醇-水（0.1%磷酸）、乙腈-水（0.1%磷酸），发现加入酸后各成分峰形明显改善。从各成分与相邻峰的分离情况及其峰形、出峰时间等方面综合分析，最终选择乙腈-水（0.1% 磷酸）作为流动相进行梯度洗脱。

3.2 检测波长筛选 本实验在200～400 nm 波长处进行紫外-可见吸收光谱扫描，发现松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A 在278 nm 处有较大吸收，而辛夷脂素在232 nm 处有较大吸收。由于辛夷脂素含量较低，并且在此波长处无干扰，故选择232、278 nm 作为检测波长。

3.3 提取条件筛选 本实验考察了不同提取方法（超声、索氏）、提取时间（30、45、60 min）、提取溶剂（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇、50%乙醇、75%乙醇）对各成分提取率的影响，发现2 种提取方法影响不大，而且在提取过程中对加热均较稳定；超声30 min 与超声45、60 min 的效果相当；50%甲醇、50%乙醇提取效果最佳，其次是75%甲醇、75%乙醇、甲醇、乙醇，但50%乙醇提取出的色谱峰数量较少，不能真实反映辛夷配方颗粒成分。最终，选择50%甲醇超声提取30 min 作为提取条件。

4 结论

本实验建立一测多评法同时测定辛夷配方颗粒中松脂素二甲醚、木兰脂素、表木兰脂素A、辛夷脂素的含量，发现所得结果与外标法无明显差异，而且该方法在对照品缺少的情况下可实现该成分定量测定，从而对该制剂进行质量控制。