炎症相关细胞因子与Ph阴性骨髓增殖性肿瘤的相关性

陈 朴， 马艳婷， 陈 楠， 于正麟， 程韵枫， 潘柏申， 郭 玮， 王蓓丽

（1.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；2. 复旦大学附属中山医院血液科，上海 200032）

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是一组以1系或多系造血系统终末细胞增殖为特征的克隆性疾病，起源于造血干细胞。MPN中最常见的亚型是经典型MPN，即费城染色体（Philadelphia chromosome，Ph）阴性（Ph-）或BCR-ABL阴性的MPN，包括真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）和原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）[1]。除已知的JAK2 V617F及12号外显子（exon12）、CALR、MPL突变是MPN的驱动因素外[2-3]，MPN还与炎症反应密切相关，基因表达谱显示许多与免疫和促炎细胞因子相关的基因在MPN中异常表达[4-5]。本研究拟通过分析MPN患者炎症相关细胞因子水平，探讨MPN发病及向骨髓纤维化转化过程中炎性指标的变化规律，揭示其在Ph-MPN进展监测、预后判断、疗效评估及疾病治疗等方面的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2017年2月—2018年2月复旦大学附属中山医院血液科门诊及住院的MPN患者50例），其中男29例、女21例，年龄（62±13）岁，包括PV 16例、ET 25例、PMF 9例。患者疾病分型诊断及骨髓纤维化分级（MF-0级：无交叉分散的线型网硬蛋白，与正常骨髓一致；MF-1级：存在许多交叉松散的网硬蛋白网，尤其是在血管周围区域；MF-2级：广泛交叉弥漫而密集的网硬蛋白增多，偶见常由胶原构成的灶性厚纤维束和/或局灶性骨硬化；MF-3级：广泛交叉的弥漫而密集的网硬蛋白增多，以及由胶原构成粗糙的厚纤维束，通常伴有骨硬化）均按世界卫生组织（World Health Organization，WHO）2016年的诊断标准确诊，排除Ph阳性或BCR-ABL融合基因阳性者。

选取同期复旦大学附属中山医院体检健康者20名作为正常对照组，其中男13名、女7名，年龄（57±11）岁。排除心脏疾病、脑血管疾病、糖尿病、结缔组织病、肿瘤、感染、肝功能损伤、肾功能损伤等。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与处理 分别使用乙二胺四乙酸二钾抗凝管（美国BD公司）及含分离促凝胶的真空采血管（美国BD公司）采集所有对象的静脉血6 mL，低温（2～8 ℃）条件下1 007×g离心10 min分离血清，分装于1.5 mL微量离心管（德国Eppendorf公司）中，-80 ℃冷冻保存备用。MPN患者外周血样本均在初诊时收集。

1.2.2 核酸提取 基因组DNA抽提试剂盒购自厦门致善生物科技股份有限公司，检测仪器为Lab-Aid 820核酸提取仪（厦门百维信生物科技有限公司）。

1.2.3 基因突变检测 采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）进行基因检测，引物序列见表1。试剂盒购自日本Takara公司，仪器为ABI Veriti PCR仪（美国ABI公司）。PCR扩增体系为15 μL，其中PCR反应液10 μL、引物F/R 1 μL、去离子水4 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共45次循环；40 ℃保温30 s。PCR扩增产物纯化后采用Sanger测序法分析JAK2及MPL基因突变情况，仪器为ABI 3130基因测序仪（美国ABI公司）。采用实时荧光PCR检测CALR基因突变情况，试剂盒购自上海源奇生物医药科技有限公司，仪器为Light Cycler 480 PCR扩增检测仪（德国Roche Lightcycler公司）。

表1 引物序列

1.2.4 细胞因子检测 采用IMMULITE 1000 全自动化学发光分析仪（德国西门子公司）及配套试剂（化学发光法）检测血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、白细胞介素2受体（interleukin 2 receptor，IL-2R）、IL-6、IL-8及IL-10水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。对计量资料进行正态分布检验和方差齐性检验。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，2个组之间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Bonfferonit检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MPN组与正常对照组各项细胞因子水平的比较

MPN组血清TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8水平均显著高于正常对照组（P＜0.001），血清IL-10水平显著低于正常对照组（P＜0.001）。2组之间血清IL-1β水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

进一步对MPN的3种亚型进行分析，PV组、ET组及PMF组血清IL-2R、TNF-α、IL-6和IL-8水平均高于正常对照组（P＜0.05），血清IL-10水平均低于正常对照组（P＜0.05）。PMF组血清IL-2R水平高于PV组和ET组（P＜0.05）。PV组、ET组及PMF组之间血清IL-1β水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 MPN组与正常对照组各细胞因子水平的比较 M（P25～P75）

2.2 MPN患者的基因突变情况

MPN患者JAK2 V617F突变的总检出率为76.0%（38/50），其中PV患者检出率为93.8%（15/16）、ET患者检出率为68.0%（17/25）、PMF患者检出率为66.7%（6/9）。MPN患者JAK2 exon12突变总检出率为2.0%（1/50，该例为PV患者）。MPN患者MPL突变总检出率为2.0%（1/50，该例为ET患者）。MPN患者CALR突变总检出率为16.0%（8/50），其中ET占75.0%（6/8），PMF占25.0%（2/8）。有2例患者（1例ET和1例PMF患者）未检测到突变，为三阴ET/PMF。3种基因突变均未见彼此有合并突变。正常对照组JAK2 V617F、JAK2 exon12、MPL和CALR突变均为阴性。

2.3 JAK2 V617F突变阳性的不同类型MPN患者各细胞因子水平的比较

PMF组JAK2 V617F突变阳性患者血清IL-2R水平显著高于PV组和ET组JAK2 V617F突变阳性患者（P＜0.01）。PMF组JAK2 V617F突变阳性患者血清TNF-α和IL-8水平高于ET组JAK2 V617F突变阳性患者（P＜0.05）。PMF组JAK2 V617F突变阳性患者血清IL-6水平高于PV组JAK2 V617F突变阳性患者（P＜0.05）。3组JAK2 V617F突变阳性患者之间其他细胞因子水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 JAK2 V617F突变阳性的不同类型MPN患者各细胞因子水平比较 M（P25～P75）

2.4 不同骨髓纤维化分级的MPN患者细胞因子水平的比较

骨髓纤维化分级为MF-3级的MPN患者血清TNF-α水平高于MF-0级患者（P＜0.05），血清IL-2R水平高于MF-2级患者（P＜0.05）。骨髓纤维化不同分级之间血清IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 不同骨髓纤维化分级的MPN患者之间各细胞因子水平的比较 M（P25～P75）

3 讨论

PV、ET、PMF是临床上最为常见的经典型MPN，其发病机制复杂。有研究结果显示，包括JAK2、CALR和MPL在内的MPN限制性驱动突变异常激活细胞因子受体/两面神激酶（janus kinase，JAK）2通路及其下游效应物与MPN的发生密切相关[6]。此类疾病由于病程迁延，且包括纤维化在内的骨髓病变具有病情隐匿、进展缓慢的特点，这给疾病的诊疗及随访带来了一定的困难。近年来，学者们发现炎症在MPN的发生、发展中起重要的推动作用，骨髓微环境的持续炎症刺激是导致基因稳定性下降及恶性克隆演化的重要诱因，而作为慢性炎症的主要因素，炎症相关细胞因子在疾病的病理生理机制中可能具有重要意义[7-8]。外周血细胞因子指标检测具有便捷、快速等优势，因此在MPN的鉴别诊断、随访及疗效评价中具有巨大的潜在临床应用价值。为此，本研究通过检测MPN患者血清TNF-α、IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8和IL-10水平，以期为寻找与疾病危险性分层及预后评估相关的新指标及开发潜在治疗监测靶点提供依据。

TNF-α是参与全身炎症反应的细胞信号传导蛋白，可诱导发热、细胞凋亡、恶病质、炎症反应，并抑制肿瘤发生和病毒复制，其过度表达与肿瘤的产生相关。IL-1β参与了机体造血系统、神经、内分泌系统的反应以及某些抗肿瘤的病理生理过程，还介导了急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病及多发性骨髓瘤的发病机制。IL-2R参与了3种细胞内信号传导途径，即丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）途径和JAK/信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）途径[9]，其主要生物学作用包括促进T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞活化增殖、抗原特异性记忆T细胞的维持等。IL-6具有调节免疫应答、调节造血系统、诱导急性期蛋白、调节肿瘤生长、调节神经内分泌系统等作用，可通过多种信号途径直接刺激多种肿瘤细胞的增殖。有研究结果显示，在多种肿瘤中有失调的IL-6及异常激活的IL-6信号传导通路[10]。IL-6-JAKSTAT信号通路在多种肿瘤模型中具有重要作用。IL-8在炎症反应、免疫调节中起重要作用，可作为炎症介质引起感染，逐渐侵袭各器官，造成器官功能低下，甚至衰竭，与多种炎性反应性疾病、肿瘤（卵巢癌、胃癌等）和免疫性疾病的发生、发展密切相关。IL-10具有双向免疫调节作用，不仅影响免疫系统，还可通过调节生长因子、细胞因子影响许多病理生理过程，包括血管生成、肿瘤形成和感染，还能通过诱导调节性T细胞在外周免疫耐受中起作用。上述指标在全身性炎症反应或炎症信号传导途径中发挥重要作用，并参与了多种肿瘤的发生、发展。

TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8具有促炎作用，是促炎细胞因子；而IL-10具有抑制炎症作用，是抗炎细胞因子。本研究结果显示，MPN患者TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8水平均显著高于正常对照组（P＜0.001），而IL-10水平则显著低于正常对照组（P＜0.001）。IL-10的双向调节作用使其在不同研究中存在争议。进一步分析不同类型MPN患者各细胞因子水平的差异，结果显示PV组、ET组及PMF组血清TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8水平均高于对照组（P＜0.05），PMF组IL-2R水平明显高于PV组和ET组（P＜0.05）。有研究结果显示，PMF患者IL-2R与白细胞计数、红细胞输注次数及JAK2 V617F突变均呈正相关[11]，提示其可作为辅助诊断PMF及随访的潜在指标。本研究结果还显示，PV组、ET组及PMF组血清IL-10水平均低于对照组（P＜0.05），这可能与MPN患者存在炎症抑制机制失常有关，提示TNF-α、IL-2R、IL-6、IL-8和IL-10在MPN的诊断中有一定的价值，且IL-2R可为MPN亚型的鉴别诊断提供依据。

本研究结果显示，JAK2 V617F突变的总检出率为76.0%（38/50），其中PV患者检出率为93.8%（15/16），ET患者检出率为68.0%（17/25），PMF患者检出率为66.7%（6/9），与文献报道[12]基本一致。MPN是一个从早期疾病发展到晚期疾病的“生物学连续”的概念，其中起驱动作用的JAK2基因突变可导致JAK2-STAT3炎症通路异常，继而引起炎症级联反应，刺激肿瘤克隆演化及疾病进展[13]。有研究结果显示，MPN由早期较低基因突变负荷的JAK2 V617F阳性ET发展到较高负荷的PV，再发展到晚期骨髓纤维化的过程中可能会造成MPN患者细胞因子谱的差异[14]。为此，本研究检测了JAK2 V617F突变阳性MPN患者中各亚型间各细胞因子的水平，结果显示，PMF组血清IL-2R水平显著高于PV和ET组（P＜0.01），血清TNF-α、IL-8水平高于ET组（P＜0.05），血清IL-6水平高于PV组（P＜0.05）。提示在JAK2 V617F突变阳性患者中，高水平的IL-2R、TNF-α、IL-8和IL-6可用于PMF的鉴别诊断。但受限于CALR突变组及MPL突变组样本数量过少，无法进行JAK2突变组与其余两者的组间比较，还有待进一步扩大样本量后深入研究。

在许多情况下，MPN的3种亚型还不能很好地界定，红细胞增多的同时可能伴有血小板的增多，甚至会出现骨髓纤维化，临床上也会出现过渡阶段的疾病状态，如PMF前期在诊断时表现出典型的ET骨髓组织学表型，但进展为MF的概率较高，而且预后比真正的ET差[15-16]。另一方面，临床上大多数PV及ET患者长期处于门诊对症治疗及随访状态，疾病症状轻微者甚至无需进行干预，但随着病程的延长，有相当一部分患者存在进展为骨髓纤维化的潜在风险，严重者会发生骨髓衰竭，但此过程往往比较隐匿，只有通过骨髓活检等侵入性手段才能加以判断。在长期随访过程中何时进行骨髓活检及其必要性的判断对临床来说是一个难题。外周血细胞因子检测具有简单、易行、微创的特点，其与MPN患者疾病进展的相关性研究可为寻找病情监测、随访的新型指标提供依据。

骨髓纤维化分级对于MPN中真性红细胞增多症后骨髓纤维化、原发性血小板增多症后骨髓纤维化、PMF前期及纤维化期PMF的判断有重要的意义。有研究结果显示，IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、干扰素诱导蛋白10（interferoninducible protein 10，IP-10）等细胞因子与MPN的纤维化转化有一定的相关性[7，17]。但可能是由于样本数有限，本研究中未明显体现。本研究结果还显示，骨髓纤维化分级为MF-3级的MPN患者血清TNF-α水平高于MF-0级患者（P＜0.05），血清IL-2R水平高于MF-2级患者（P＜0.05）。这提示TNF-α、IL-2R水平或许可作为骨髓纤维化分级的参考指标。有关炎性细胞因子在骨髓纤维化早期诊断及分级中的价值仍需不断深入研究。

综上所述，MPN患者炎症相关细胞因子（TNF-α、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10）水平异常，且在3种MPN亚型（PV、ET及PMF）中也存在差异，可作为MPN诊断和分型的参考指标，并可作为疾病演化进展分型的依据。此外，炎症相关细胞因子与MPN骨髓纤维化的发展密切相关，在骨髓纤维化早期诊断、分级及协助判断骨髓活检时机方面有很高的临床价值。由于本研究样本量较小，未能根据JAK2、CALR和MPL基因突变检测结果对不同基因突变患者进行分组分析，以得出更精确的结论。因此，炎症相关细胞因子在MPN诊断及分型中的作用仍有待进一步深入研究。