抗菌聚己内酯/聚乳酸纳米纤维膜的制备及其性能

王英沣,殷茂力，杨 钊,李广滔,周胜武

(安徽工程大学 纺织服装学院，安徽 芜湖 241000)

皮肤作为人体最大的器官，是人体机能维持和保护最重要的屏障，也是机体免疫系统重要的组成部分。由于各种外伤或病理性因素导致皮肤的损伤或缺失，会对人体的健康造成影响，严重时甚至危及生命。因此,需要开发一种具有优良性能的创伤敷料，以利于皮肤创面的修复。静电纺丝技术由于其操作较为简单，成本较低，非织造网状的多孔结构被广泛应用于创伤敷料的制备过程。相较于天然高分子材料，合成高分子材料具有易于加工、性能稳定等特点，从而被广泛应用于静电纺丝法制备的医用敷料中。此外，医用敷料使用后的环保问题同样是必须考虑的因素。因此，可降解高分子材料在医用敷料领域受到了越来越多的关注。

聚己内酯(PCL)是一种二元醇引发组合，并由己内酯聚合形成的一种线型高分子化合物。PCL材料具有良好的柔韧性和加工性能，被广泛应用于可降解材料、医疗卫生、纳米纤维纺丝、塑料材料等领域。但作为静电纺丝材料，纯PCL的纤维成形性和均匀度较低，无法符合医用敷料的相应使用需求。基于此，需要添加一种可纺性能优异的可降解高分子材料以改善PCL可纺性差的问题。聚乳酸(PLA)是一种通过乳酸的共沸脱水缩聚形成的聚合材料，相关原料可由木薯、小麦、玉米等农作物中获得，是一种理想的可再生环保降解材料。基于此，可以通过对PCL和PLA共混静电纺丝制备可降解的医用敷料，达到材料性能互补的作用。为了保证复合纳米纤维膜的抗菌性能，在静电纺丝过程中常常掺杂抗菌剂进行共混纺丝，达到赋予材料抗菌性能的目的。卤胺由于其高效、抗菌持久、抗菌性能可再生等特点，被广泛应用于静电纺丝材料中。

研究中采用PCL和PLA作为静电纺丝材料，通过添加卤胺小分子制备具有优异抗菌性能的复合纳米纤维膜。系统探究了材料的储藏稳定性能及降解性能的变化规律，并对材料的抗菌性能进行了分析和研究，为医用可降解敷料的制备和研究提供了一些新的思路和方向。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

聚己内酯(PCL，重均分子量15万，上海百灵威科技有限公司)；聚乳酸(PLA，重均分子量8万，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲(DCDMH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；LB营养琼脂、LB MILLER肉汤、胰酪大豆胨琼脂及胰酪大豆胨肉汤,均购自北京奥博星生物科技有限公司；甲醇、氯仿、无水乙醇等其他药品,均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 复合纳米纤维膜的制备

(1)称取一定量的PCL和PLA固体(w/w，1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1)，分批溶解于20 mL氯仿/甲醇混合溶液中(v/v，2∶1)，采用磁力搅拌的方式室温搅拌6 h(200 r/min)，配制浓度均一的澄清溶液。为保证实验条件一致，配制的PCL/PLA纺丝溶液浓度为10 wt%；纺丝工艺：纺丝电压15 kV，纺丝距离25 cm，纺丝速度2 mL/h，针头往返移动距离100 cm，接收辊筒转速150 r/min。

(2)选取步骤(1)中最佳PCL/PLA纺丝比例，分批溶解于20 mL氯仿/甲醇混合溶液中(v/v，2∶1)，于室温下采用磁力搅拌的形式(6 h，200 r/min)配制浓度为10 wt%的均一澄清溶液。添加不同比例的卤胺抗菌剂DCDMH(3 wt%、5 wt%、7 wt%、9 wt%、11 wt%)至上述溶液中继续搅拌1 h。待DCDMH完全溶解后，采用相同纺丝工艺进行纺丝，制备复合纳米纤维膜。待纺丝完成后，将辊筒上铝箔纸揭下，并置于45 ℃鼓风干燥箱中干燥12 h备用，所得到的纳米纤维膜样品分别标记为：PCL/PLA-3、PCL/PLA-5、PCL/PLA-7、PCL/PLA-9、PCL/PLA-11。

1.3 复合纳米纤维膜的含氯量测试

采用碘化钾/硫代硫酸钠滴定法对样品的活性氯含量进行标定。样品中的卤胺结构在水分子的作用下形成氯正离子，与碘离子反应后形成单质碘，并在淀粉的作用下生成蓝色物。通过硫代硫酸钠的作用将碘单质氧化成碘离子，使溶液颜色消失，进而标定样品中卤胺活性氯的含量。具体操作方法如下：称取一定量的样品，剪碎后放入烧杯中，加入20 mL去离子水并于室温下持续搅拌。30 min后，称取2 g碘化钾，与几滴1 wt%的淀粉溶液一并加入上述烧杯中，继续搅拌30 min。随后采用硫代硫酸钠对溶液进行滴定，直至溶液褪色至无色，并记录硫代硫酸钠用量。样品的含氯量计算公式如式(1)所示。

(1)

式中，

N

为硫代硫酸钠当量浓度(N)；

ΔV

为硫代硫酸钠用量(L)；

W

为样品质量(g)。

1.4 复合纳米纤维膜降解性能测试

裁剪一定大小的复合纳米纤维膜，于45 ℃真空干燥箱中干燥1 d备用。对干燥后的样品进行称重后，浸泡至PBS溶液中，并放入培养箱中恒温37 ℃静置。每隔一天对样品中的PBS溶液进行更换。待一定时间后(5 d、10 d、20 d、30 d)，将样品从PBS溶液中取出，并使用大量去离子水冲洗，随后使用滤纸吸干样品表面水分。待放入冰箱中冷冻，并将样品放入冷冻干燥机中干燥后，称取相应样品重量。样品的降解性能由式(2)计算得出；样品表面形貌由扫描电镜(SEM)进行观测。

(2)

式中，

m

表示样品降解前质量；

m

表示样品降解后质量。

1.5 复合纳米纤维膜储藏稳定性能测试

裁剪一定大小的复合纳米纤维膜，装入自封袋避光保存。分别放置5 d、10 d、20 d、30 d后，取出相应样品，并使用硫代硫酸钠滴定样品中的活性氯含量。计算公式如式(1)所示。

1.6 接触性抗菌性能测试

(1)细菌培养。用接种环刮取一定量的细菌，并加入装有5 mL液态培养液(Broth)的玻璃管中；涡旋使细菌分散均匀，并将玻璃管置于恒温摇床中37 ℃震荡培养(120 r/min)。待细菌培养18～24 h后，离心分离细菌，并采用5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)对细菌进行洗涤。最后取0.1 mL上述分散均匀的细菌/PBS悬浮液，加入新的装有Broth的玻璃管中，并放入振荡箱中继续恒温培养，此为一代细菌。将上述细菌繁殖三代后备用。

(2)抗菌性能测试。将样品裁剪成2.54 cm×2.54 cm大小备用。在无菌操作台中将一片样品放置于培养皿表面，滴加25 μL细菌悬浮液；将另一片样品以“三明治”的形式覆盖在样品表面，并使用无菌重物压紧，以保证菌液与样品的充分接触。待一定时间后(1 min、5 min、10 min、30 min)，将两片样品放入5 mL 0.02 N的硫代硫酸钠溶液中，以猝灭样品表面残存的活性氯。将上述淬灭后溶液涡旋10 s后，采用100 mmol/L PBS溶液进行连续稀释，并均匀滴加至固体培养皿表面。待培养皿于37 ℃下培养24 h后，对样品的菌落数进行测定，并计算抗菌率。空白样操作与上述实验样相同，接触时间采用30 min。样品的抗菌性能通过如下公式进行计算：

(3)

细菌对数减少值=

LogN

-

LogN

,

(4)

式中，

N

为样品细菌菌落数；

N

为空白样细菌菌落数。

1.7 测试与表征

复合纳米纤维膜制备采用汇智电纺设备，并于实验室自行组装完成，静电纺丝所用高压直流电源来自东文高压电源(天津)股份有限公司。样品形貌分析采用扫描电子显微镜(SEM，Hitachi S4800)对样品表面进行观察；样品化学结构采用傅里叶红外光谱分析仪(FT-IR，Nicolet iS5)对样品的化学结构进行表征，扫描范围为500～4 000 cm。

2 结果与讨论

2.1 复合纳米纤维膜化学结构及微观形貌分析

聚乳酸和聚己内酯的不同性能使得它们在不同的溶剂体系中的溶解状况发生不同的变化，进而导致纺丝后出现多种不同的纤维形貌。前期研究发现，聚己内酯在纯氯仿溶剂体系中很难通过静电纺丝制备细度分布均匀的纳米纤维膜。基于此，我们采用氯仿/甲醇体系作为方式的溶剂体系，制备所需的纳米纤维膜。

静电纺丝制备的纳米纤维膜的表面形貌图像如图1所示。由图1可知，所有纳米纤维均呈现一定的光滑、无规则的纤维形态，并没有珠结点产生。当溶质体系中PCL用量增加时，纳米纤维膜的均匀度遭到一定破坏，纳米纤维之间发生粘结现象，纳米纤维的取向度以及纤维的均匀度仍然较差。实验中对各样品的直径进行了分析和统计，不同比例PCL/PLA(1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1)的单根纤维直径分别为：518 nm、251 nm、486 nm、1 008 nm、438 nm。其中PCL/PLA纺丝比例为5∶5时，纤维的整体形貌最好，纤维直径尺寸最细，更有利于后期研究及应用。因此，选取纤维均匀度和表面形貌最佳的PCL/PLA比例(PCL∶PLA=3∶7)进行后续的静电纺丝研究工作。

图1 纳米纤维膜的SEM图像及直径分布

基于上述最佳工艺，添加不同量的DCDMH至PCL/PLA纳米纤维膜中，相关氯含量的影响和红外光谱图测试如图2所示。基于卤胺结构的特性，卤胺化合物的抗菌性能的高低可由氯含量的大小决定。前期研究发现，卤胺改性纳米纤维膜类材料的活性氯含量高于0.1 wt%时，样品即可具备较好的抗菌效果。基于此，分别对PCL/PLA-3、PCL/PLA-5、PCL/PLA-7、PCL/PLA-9和PCL/PLA-11的氯含量进行测试。由测试结果可以发现，纳米纤维膜的氯含量随着DCDMH的添加呈现逐渐上升的趋势。当DCDMH添加量从5 wt%调整至7 wt%时，样品氯含量增加率最高；PCL/PLA-7的氯含量可达到0.17±0.01 wt%。因此，从抗菌效果及经济化角度考虑，选取PCL/PLA-7作为最佳比例的复合纳米纤维膜。

DCDMH添加对PCL/PLA纳米纤维膜的化学结构影响如图2b所示。由于PCL、PLA以及DCDMH化学结构相似，位于2 945 cm及2 865 cm处的强衍射峰是由于甲基和亚甲基的对称及非对称伸缩振动引起的；于1 725 cm处出现的强衍射峰属于羰基的伸缩振动峰。由图2b可以看出，PCL/PLA-7样品的羰基衍射峰明显强于PCL/PLA，这是由于DCDMH中的酰胺及酰亚胺结构增强了该处吸收峰的强度。

图2 DCDMH添加对PCL/PLA纳米纤维膜的影响

为了进一步证明卤胺小分子混入纳米纤维膜中，对PCL/PLA以及PCL/PLA-7的XPS能谱进行测试，其结果如图3所示。由图3可以发现，当加入DCDMH后，PLC/PLA-7的谱图中明显地出现了N元素(N 1s：399.54 eV)及Cl元素(Cl 2p:199.54 eV)的衍射峰。由于PCL和PLA结构中不存在N元素和Cl元素，所以这是由DCDMH中的酰胺结构和卤胺结构所引入的。结合红外光谱测试结果可以证明，DCDMH成功地混入了PCL/PLA纳米纤维膜中，并且对卤胺结构未造成影响。

2.2 复合纳米纤维膜的降解性能

基于复合纳米纤维膜的应用领域，对样品(PCL/PLA-7)在模拟人体体温及体液条件下的降解性能进行测试。复合纳米纤维膜的降解性能如图4所示。由图4可以发现，样品在前10天降解速度较快，样品降解率在10 d时达到了5.4 wt%。随后样品的降解趋于平缓，于30 d后样品的降解率达到7.4 wt%，样品的降解速率相对恒定。PCL/PLA-7可以在无酶环境下实现缓慢的降解，分子结构中的酯键发生断裂造成高分子分解，进而分解成二氧化碳和水。对降解30 d后的PCL/PLA-7的表面形貌进行观测，其扫描电镜图像如图5所示。对比原样可以发现，纤维表面光洁度及均匀度出现了极大的下降，纤维的表面形貌遭到了一定破坏；但是，降解30 d后的样品仍然具备一定的纤维及非织造材料的形态结构，说明样品在经过一段时间降解后，仍能保持一定的结构和物理性能。

图3 复合纳米纤维膜XPS图 图4 复合纳米纤维膜的降解性能

图5 体外降解前和30 d后样品表面的SEM图

2.3 复合纳米纤维膜储藏稳定性能

复合纳米纤维膜储藏稳定性也是实际应用中较为重要的性能指标。因此，对PCL/PLA-7室温避光保存情况下的氯含量进行测试，以此来检测样品的抗菌性能的稳定性。样品存储稳定性能测试如图6所示。由图6可以发现，样品的含氯量在10 d内下降较为迅速，这是空气中的水分子与样品中的卤胺结构反应，N-Cl键分解造成的。卤胺结构可在合适的条件下与水分子发生反应并水解，生成次氯酸结构，进而导致含氯量的降低。在随后的存储时间内，样品的含氯量并未发生大幅降低的情况；30 d后PCL/PLA-7的含氯量可达到(0.12±0.01) wt%。基于前期研究，PCL/PLA-7在存储30 d后，仍然具备较好的抗菌性能。

图6 样品存储稳定性能测试

2.4 复合纳米纤维膜的抗菌性能

抗菌性能是医用敷料的重要性能指标之一；优良的抗菌性能不但能保证样品表面的清洁程度，同时可以减少患者被感染的概率，极大地减少患者的痛苦。实验中采用“三明治式”接触法对样品的抗菌性能进行测试。实验中采用的金黄色葡萄球菌的接种浓度为3.75×10CFU/sample，大肠杆菌O157:H7接种浓度为2.25×10CFU/sample，样品氯含量为(0.17±0.01) wt%。样品的抗菌性能如表1所示。由表1可知，PCL/PLA-7展现了优异的抗菌性能，分别可在接触时间为5 min及10 min内完全杀灭数量级为7的大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌，且样品对大肠杆菌O157:H7的抗菌效果要略高于金黄色葡萄球菌。造成上述结果的原因主要有两点：①金黄色葡萄球菌的整体细菌浓度要高于大肠杆菌O157:H7，大肠杆菌O157:H7的细菌浓度仅为金黄色葡萄球菌的60%；②细菌表面主要由肽聚糖组成，而大肠杆菌O157:H7的肽聚糖细胞膜的厚度(7～8 nm)要比金黄色葡萄球菌的细胞膜厚度(20～80 nm)薄，因此更容易发生溶解进而导致细菌的死亡。值得注意的是，PCL/PLA样品在与细菌接触30 min后，细菌同样发生了一定的减少，这是由于样品在与细菌涡旋分离时，部分细菌粘附在样品表面。以金黄色葡萄球菌为例，通过培养皿的直观显示了PCL/PLA-7的抗菌效果如图7所示。

表1 样品抗菌性能测试

图7 样品对金黄色葡萄球菌抗菌效果图

3 结论

可降解材料的抗菌性能和降解性能是材料应用过程中最为主要的性能之一。基于此，本研究通过静电纺丝的形式，制备了负载卤胺抗菌剂的复合纳米纤维膜。PCL和PLA高分子在甲醇/氯仿体系中可以充分互溶，得到直径均匀的纳米纤维膜。采用综合性能最佳的纳米纤维膜(PCL∶PLA=3∶7)与卤胺小分子抗菌剂(MCDMH)结合，制备具有抗菌性能的复合纳米纤维膜。当MCDMH添加量为7 wt%时，材料即可获得较佳的抗菌效果，可在5 min和10 min内杀死100%的大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌。材料储藏稳定性良好，30 d避光保存后仍可达到材料的抗菌要求。降解测试表明，材料在模拟体液中存在较好的降解行为，降解30 d后降解率为7.4 wt%，且材料仍保持一定的物理结构和性能。上述研究为可降解材料的抗菌性能领域提供了新的思路及方向，在医用材料领域具有潜在的应用价值。