乳清蛋白水解物对产胞外多糖L.paracasei LX 5的促生长作用研究

白英，殷佳棋，兰秀芬，王纯玮

（内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，呼和浩特 010018）

0 引 言

由于乳酸菌水解蛋白的能力很弱，以MRS作为培养基满足不了乳酸菌对氨基酸的营养需求，导致生长缓慢[1]。而添加来源于禽肉加工残渣的蛋白质水解物，可促进双歧杆菌和乳酸杆菌的生长[2]。2%的乳清蛋白可明显促进双歧杆菌的生长[3]。酪蛋白水解物可使双歧杆菌的活菌数和胞外多糖(exopo lysaccharides,EPS)产量均达到最高[4]。乳清蛋白水解物(Whey Protein H ydro lysate,WPH)可增加嗜热链球菌的活菌数及胞外多糖的产量[5]。K itagishi[6]等发现，酪蛋白水解物和乳清蛋白水解物均可增加胞外多糖的产量。将乳清蛋白水解物以不同比例替代MRS液体培养基可以促进双歧杆菌的生长[7]。以乳清作为培养基，嗜热链球菌在3 h后，活菌数达到0.42×109CFU/m L[8]。而大豆分离蛋白、牛乳清蛋白和蛋清蛋白的水解物均可促进双岐杆菌等乳酸菌的生长[9]。

1 实 验

1.1 材料与试剂

产胞外多糖L.paracasei LX 5，由本实验室分离自锡盟发酵奶油[10-11]；乳清蛋白，上海紫一试剂厂；碱性蛋白酶，北京酷来搏科技有限公司；茚三酮显色剂、氢氧化钠、盐酸、乙醇溶液等均为分析纯，蛋白质分子量标准14.4～94.0 ku，天根生化科技(北京)有限公司；预染低分子量Marker，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，北京化学试剂公司；T ris、SDS，比奥罗克公司；过硫酸铵，北京化工厂；甘氨酸，山东丰泰生物科技有限公司；考马斯亮蓝G 250北京鼎国生物技术发展中心；MRS肉汤培养基，北京索莱宝科技有限公司；β-巯基乙醇，上海百赛生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白溶液的制备流程

6%乳清蛋白→80℃水浴20min→冷却→5 000 r/min离心10min→取上清液，4℃冰箱保存备用

1.2.2 响应面实验设计

在单因素实验的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Benhnken中心组合设计原理[12－13]，以水解度为响应值，以温度、pH值、酶与底物比作为自变量，设计15个实验点的三因素三水平响应面分析实验，以建立数学模型，从而得出最佳组合条件，并对结果进行验证。以建立数学模型，分别表示为X1，X2，X3；且用+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，中心点进行3次试验，用以估计误差。按方程Xi=(xi-x0)/x对自变量进行编码，其中，Xi为编码值，xi为真实值，x0为实验中心点处的真实值，X为变化步长，响应面分析试验因素水平和编码如表1所示。

表1 响应面分析实验因素水平和编码

1.2.3 乳清蛋白SDS-PAGE电泳分析

按表2分别将超纯水、质量分数30%丙烯酰胺、浓缩胶缓冲液、质量分数10%的SDS混合，加入质量分数10%过硫酸铵和TEMED，立即混合5～10 s。先60 V电泳30～60 min至分离胶处，再150 V电泳至样品距分离胶下沿约1 cm处，结束电泳。

表2 大分子蛋白质SDS-PAGE电泳凝胶配制

1.2.4 乳清蛋白水解物T ricine-SDS-PAGE电泳分析

按表3分别将质量分数40%聚丙烯酰胺(29∶1)、4×凝胶缓冲液、超纯水混合，加入质量分数10%过硫酸铵和TEMED，立即混合5～10 s。先80 V电泳30～60 min至分离胶处，再120 V电泳至样品距分离胶下沿约1 cm处，结束电泳。

表3 小分子蛋白质Tricine-SDS-PAGE电泳凝胶配制

1.2.5 超滤

取两支10 ku，1 500μL的超滤管，分别加入15m L去离子水，于冰箱中预冷10 min。将水倒出，在超滤管中分别加入10 m L的WPH溶液，转速3 500 r/min离心20 min，收集管底的样品，加入样品，重复此步骤直至结束，得到10 ku上下两部分的WPH。将分离得到的水解液于真空冷冻干燥机中冻干，得到粉末状的WPH。

1.2.6 WPH不同超滤成分对乳酸菌的增菌作用

将高于10 ku、低于10 ku两个分子量范围的WPH以0.1 g/100 m L的添加量添加到MRS液体培养基中(标记为MRSⅠ、MRSⅡ)，然后将活化三代的L.paracasei LX 5接种于MRS、MRSⅠ、MRSⅡ三种培养基中，接种量为3%，37℃培养24 h。采用活菌计数法检测其对L.paracasei LX 5的增菌作用。

1.2.7 WPH不同超滤成分对EPS产量的影响

将低于10 ku、高于10 ku两个分子量范围的WPH以0.1 g/100 m L的添加量添加到MRS液体培养基中(标记为MRSⅠ、MRSⅡ)，将活化三代后的L.paracasei LX 5接种于MRS、MRSⅠ、MRSⅡ三种培养基中，接种量为3%，37℃培养24 h。分别取10 m L菌液，10 000 r/min离心10 min，取上清液，分别加入三倍体积的95%冷乙醇，4℃过夜后以10 000 r/min转速离心20 min。弃去上清液，收集管底沉淀，用蒸馏水溶解。将溶液放入透析袋中,透析12 h，每2 h更换1次蒸馏水。透析结束后采用苯酚-硫酸法[14]检测490 nm处的吸光值，根据葡萄糖标准曲线及样品稀释倍数计算乳酸菌EPS的含量。

2 结果与分析

2.1 响应面法(RSM)优化水解参数

2.1.1 响应面模型的建立及统计分析

通过前期单因素实验确定因素水平，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以三个相关性紧密的因素(温度、pH值、酶底比)为自变量，水解度为响应值优化水解参数。设计方案及结果分析如表4所示。

对试验结果进行二次回归拟合分析，确定水解度与各因素之间为二次模型关系，得到了以水解度为目标，温度、pH、酶与底物比为因素的二阶编码值回归方程：

根据表5的回归模型的方差分析及回归模型系数的显著性检验结果可看出，该响应面模型的F值为61.93，P＜0.01，证明该回归模型极显著，失拟项不显著(P＞0.05),相关系数R2为0.9911，可得知预测值与测定值之间有高度相关性，而且模型校正决定系数RAdj=0.9751,表明此模型可以解释97.51%响应值的变化情况，总变异中只有1.04%的变异不可以由该模型解释，表明该模型与实际拟合良好，各影响元素与水解度之间的实际关系可用该方程来描述，故可用此模型对试验结果进行分析与预测。

表4 响应面分析实验方差与结果

表5 水解度DH(%)响应面模型方差分析结果

由表5可以看出，X1和X2的P值小于0.05，说明温度和pH值对乳清蛋白水解度的影响显著，X3的P值小于0.01，表明E/S对水解度的影响极显著；交互项中X1X2，X1X3，X2X3之间的协同作用对乳清蛋白水解度的影响均不显著；二次项X12,X32对水解度的影响极显著，X22对水解度的影响不显著。P值越小各因素对响应值的影响越显著，所以，温度、pH值、酶与底物比3个因素对水解度的影响顺序依次为：酶与底物比＞pH＞温度。

2.1.2 模型的响应面分析

根据模型分别将回归模型中的两个因素固定在中心点水平以便于直观描述各因素对响应值的影响，构建了另外两个因素交互作用的响应曲面图。图1，图2和图3分别表示各个因素对蛋白水解度影响的响应面图和等高线图。利用响应面可以评价实验因素对蛋白水解度的两两交互作用，可以清楚的看到，各因子对响应值的影响变化趋势和模型具有最大值。

图1 温度与pH值对乳清蛋白水解度影响的响应曲面图及等高线

图2 温度与E/S对乳清蛋白水解度影响的响应曲面图及等高线

图3 pH值与E/S对乳清蛋白水解度影响的响应曲面图及等高线

根据图1和图2可知，在因素考察的范围内，当温度升高时，水解度呈先增高后降低的趋势，从其等高线图可知，温度与pH值、E/S的交互作用不显著；在温度到达55℃左右时，水解度达到本次实验中的最大值。由图1、图3可知，在因素所考察的范围内，随着pH的升高，水解度呈现先增高后降低趋势，由等高线图可知，pH值与温度、E/S的之间的交互作用不显著；当pH在8.0附近有最大值。由图2、图3可知，在因素所考察范围内，随着E/S的升高，水解度呈现先增高后缓慢增高趋势，从等高线图可以看出E/S与pH值、温度的交互作用不显著；当E/S为0.05左右时，水解度处于最优点。

2.2 最佳参数及验证实验

利用寻优程序对回归模型方程进行寻优处理进而明确各因素的最优条件，得到水解度为最大值时的条件为X1=54.59，X2=8.28，X3=0.05。即温度为54.59℃，pH值为8.28，E/S为0.05。在此最优条件下，水解度的预测值为21.65%。按上述条件进行验证试验来检验此模型的有效性与可靠性。考虑到实际情况，把实验参数修正为温度55℃，pH值8.0，E/S=0.05，在此条件下进行实验，并重复3次，得到水解度的实际平均值为21.73%±0.36%。水解度的预测值与实际值的结果无较大差距，这证明了模型的有效性，表明响应面法分析各因素对水解度的影响的方式值得信赖，且有实际的参考价值。

2.3 SDS-PAGE电泳分析

6%乳清蛋白溶液与6%乳清蛋白水解液的电泳结果如图4所示。从电泳条带可知，乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白和牛血清白蛋白4种成分。其中牛血清白蛋白的分子量在66.2 ku左右；在电泳中免疫球蛋白在β-巯基乙醇的作用下被水解为重链和轻链，轻链分子量25 ku，重链为55～75 ku，轻链由于扩散在电泳中，几乎看不到[15]。β-乳球蛋白的分子量在20.0～26.0 ku之间,α-乳白蛋白的分子量介于14.4～20.0之间。而质量分数为6%的WPH没有电泳出条带，说明该方法不适合小分子蛋白的分离。

图4 SDS-PAGE电泳结果

2.4 T ricine-SDS-PAGE电泳分析结果

6%乳清蛋白水解液的电泳结果如图5所示。由图5可以看出，乳清蛋白水解液中包含3个分子量范围的蛋白质，分别为4.6～10，10，16～27 ku。相比于图4，可以看出乳清蛋白中各组分的蛋白质在碱性蛋白酶的作用下均得到了较好的降解，大分子的肽段被降解成了小分子肽段。

图5 Tricine-SDS-PAGE电泳结果

图5中，WPHⅠ为稀释一倍的乳清蛋白水解物。

2.5 两种电泳方法的比较

SDS-PAGE电泳和T ricine-SDS-PAGE电泳这两种电泳方法的比较如表6所示。两种电泳方法的区别主要体现在在分离胶浓度、浓缩胶浓度、电泳缓冲液配制、电压和电泳对象这几方面。同时说明了SDS-PAGE电泳适合于大分子蛋白的分离，T ricine-SDS-PAGE电泳适合于小分子蛋白的分离。

2.6 WPH不同超滤成分对乳酸菌的增菌作用

WPH不同超滤成分的增菌效果如图6所示。由图3可以看出，L.paracasei LX 5在MRS培养基中的活菌数为199.67 CFU/m L，在MRSⅠ培养基中的活菌数为263.67 CFU/m L，在MRSⅡ培养基中的活菌数为280.33 CFU/m L。由此可知，高于10ku的WPH和低于10 ku的WPH均表现出了对L.paracasei LX 5的增菌作用。低于10 ku的WPH相对于高于10 ku的WPH的增菌作用更加明显。Lucas[16]等的研究表明，分子质量在0.5～1.5 ku之间的乳蛋白水解肽对于嗜热链球菌的增长有明显的的促进作用。

表6 两种电泳方法的比较

图6 L.paracasei LX 5活菌数

2.7 WPH不同超滤成分对乳酸菌EPS产量的影响

2.7.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖量为横坐标，490 nm下的吸光值为纵坐标绘制出的标准曲线如图7所示，该曲线与线性方程y=0.0094x+0.037拟合良好，R2=0.9924，葡萄糖的质量浓度为10～100m g/L。

图7 葡萄糖标准曲线

2.7.2 乳酸菌EPS产量的测定

EPS的产生取决于培养基的温度、pH值以及培养基中碳、氮、矿物质和维生素含量的组成[17，18]。增加培养基中的氨基酸或肽的量可促进乳酸菌的增长,同时可提高胞外多糖的产生量[19]。由图8可以看出，L.paracasei LX 5在MRS培养基中的EPS产量为101.91 m g/L，在MRSⅠ培养基中的EPS产量为161.14 m g/L，在MRSⅡ培养基中的EPS产量为241.24 m g/L。由此可知，高于10 ku的WPH和低于10 ku的WPH均显示出了对L.paracasei LX 5 EPS产量的促进作用。低于10 ku的WPH相对于高于10 ku的WPH的对EPS产量的促进作用更加明显。

图8 L.paracasei LX 5胞外多糖产量

3 结 论

经SDS-PAGE电泳分析，6%WPH没有电泳出条带，说明该方法不适合小分子蛋白的分离。而经T ricine-SDS-PAGE电泳分析，得到了WPH的三条电泳条带，其分子量分别为4.6～10，10，16～27 ku。相比于乳清蛋白的电泳结果，可以看出乳清蛋白中各组分的蛋白质在碱性蛋白酶的作用下均得到了较好的降解。根据T ricine-SDS-PAGE电泳结果将WPH采用超滤的方法进行分离与收集，得到高于10 ku和低于10 ku两种组分的WPH。分别将其加入到MRS培养基中进行培养，结果表明，两个分子量范围的水解物均对L.paracasei LX 5的活菌数和EPS产量起到了促进作用，且低于10 ku的水解物比高于10 ku的水解物的促进效果更加明显。