小檗皮HPLC 指纹图谱建立及不同品种模式识别

徐鑫梅，易 欢，赖先荣，冯 图，李 琪，蒋桂华∗，范 刚∗

（1.成都中医药大学药学院，四川成都 611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川成都 611137；3.贵州工程应用技术学院生态工程学院，贵州毕节 551700）

小檗皮为小檗科植物甘肃小檗Berberis kansuensisSchneid.及其同属多种植物的干燥内皮［1］，能清热、解毒、燥湿，常用于治疗痢疾、尿路感染、肾炎、结膜炎等疾病［2-3］。《晶珠本草》 中记载有“小檗皮性凉、糙，能敛诸毒，干黄水”［4］。现代药理学研究发现，小檗皮可有效降低四氧嘧啶所致糖尿病模型小鼠血糖水平，能防治糖尿病小鼠视网膜病变，并能改善受损的视网膜微血管形态［5-8］。小檗皮为典型的多基原藏药材，同属多种植物均能入药。课题组前期对小檗皮进行了详细的资源调查及文献考证［9］，发现目前各藏医院、藏药厂及药材市场上使用的主流品种包括甘肃小檗Berberis kansuensisSchneid.、鲜黄小檗Berberis diaphanaMaxim.和匙叶小檗Berberis vernaeSchneid.等。小檗皮药材的基原多样性和混淆使用不利于市场监管，也影响其质量稳定性和临床使用。因此，建立简便、可行的品种鉴别方法对于小檗皮药材的质量控制具有重要的意义。

现代研究表明，小檗皮药材主要含有小檗碱、木兰花碱、巴马汀等生物碱类成分［10-12］。张琦等［13］采用HPLC 法测定了小檗皮中小檗碱的含量；莫家祺等［14］采用紫外分光光度法测定了总生物碱含量；李琪等［15］采用HPLC 法对小檗皮药材中6 种成分进行含量测定。然而，单一成分或多成分的含量测定仍不够全面，不能完全反映小檗皮药材的内在质量。指纹图谱具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点，可充分反映各成分分布的整体情况［16-18］。因此，本研究首次建立了小檗皮药材的HPLC 指纹图谱，运用相似度评价、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）对不同品种的小檗皮药材进行综合评价，以期为其基原鉴定及质量控制提供参考。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Sartorius BP121s 电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；ULUP-I-10T 优普超纯水机（成都超纯科技有限公司）；CQ-250 超声波清洗器（上海必能信有限公司）。

蟾毒色胺内盐、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品均由本课题组自制，经HPLC 检测纯度均＞99%；木兰花碱（批号MUST-18071701，纯度＞99%）对照品购于成都曼思特生物科技有限公司；药根碱（批号Y-023-141201）、巴马汀（批号H-015-150808）、小檗碱（批号Y-035-150818）对照品均购于四川赛因斯特生物科技有限公司，纯度均＞98%。磷酸、乙腈为色谱纯；甲醇、盐酸为分析纯；水为超纯水。本研究共收集15 批小檗皮，采用植物分类学及课题组前期建立的DNA 条形码方法［9］鉴定分别为鲜黄小檗Berberis diaphana、匙叶小檗Berberis vernae和甘肃小檗Berberis kansuensis，具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 WondaSil® C18-WR 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～12%A；10～15 min，12%～15%A；15～20 min，15%～18% A；20～30 min，18%A；30～40 min，18%～30%A）；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；检测波长210 nm；进样量10 μL。

表1 样品信息

2.2 对照品溶液制备 精密称取小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱、蟾毒色胺内盐、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷适量，置于5 mL 量瓶中，甲醇制成1.500、1.725、1.950、1.925、2.950、2.590 mg／mL 贮备液。分别精密量取2 mL 置于同一25 mL 量瓶中，甲醇制成每1 mL 含小檗碱0.120 mg、巴马汀0.138 mg、药根碱0.156 mg、木兰花碱0.154 mg、蟾毒色胺内盐0.236 mg、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷0.207 mg 的溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备 取药材粉末（过3 号筛）约0.2 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-70%甲醇（1∶100）溶液50 mL，称定质量，超声30 min，放冷，再称定质量，盐酸-70%甲醇（1∶100）溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 空白试验 取盐酸-70% 甲醇（1∶100）溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，发现溶剂对小檗皮指纹图谱测定没有干扰。

2.4.2 完整试验 取样品（S15）约0.2 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，记录120 min 的色谱图。结果，60 min 后未出现色谱峰，可完整记录小檗皮样品各化学成分信息。

2.4.3 精密度试验 取样品（S15）约0.2 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次。结果，以木兰花碱为参照峰时，各共有峰相对保留时间RSD＜0.6%，相对峰面积RSD＜2.9%。将其色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 年A 版）进行评价，发现其相似度均大于0.999，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取样品（S15）约0.2 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下于0、1、2、3、4、6、12、24 h 进样。结果，以木兰花碱为参照峰时，各共有峰相对保留时间RSD＜0.6%，相对峰面积RSD＜3.0%。将其色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 年A 版）进行评价，发现其相似度均大于0.999，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取样品（S15）6 份各0.2 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样。结果，以木兰花碱为参照峰时，各共有峰相对保留时间RSD＜2.9%，相对峰面积RSD＜3.0%。将其色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004年A 版）进行评价，发现其相似度均大于0.975，表明该方法重复性良好。

2.5 样品含量测定 参照课题组前期建立的HPLC 含量测定方法［15］，对15 批样品6 种成分含量进行测定，并将结果导入SIMCA-P 14.1 软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。PCA 模型自动拟合选择了4 个主成分，其累计贡献率为94.6%，PCA 得分图见图3A，可知鲜黄小檗和匙叶小檗不能得到有效的区分。此外，PLS-DA 分析参数分别为R2X ＝84.6%、R2Y ＝81.3%、Q2＝43.0%，表明模型良好；PLS-DA 得分图见图3B，与PCA 结果相似，两者仍然不能得到明显的分类。

2.6 HPLC 指纹图谱建立及相似度评价

2.6.1 参照峰选择 木兰花碱为小檗皮质量评价的重要指标之一，每批样品中均含有这种成分，其色谱峰在色谱图中分离度良好，峰面积最大，保留时间和峰面积较为稳定，故选择其作为参照峰。

2.6.2 指纹图谱建立 15 批药材按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，其色谱图以AIA 格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 年A 版）。将S1 号样品的图谱设为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度设为0.5 min，进行多点校正和色谱峰匹配，最终确定了13 个共有峰，得到指纹图谱叠加图，并生成对照指纹图谱，见图1。

图1 15 批样品HPLC 指纹图谱

2.6.3 共有峰确认 将小檗皮对照指纹图谱与标准品图谱比对，指认了其中6 个共有峰，分别为蟾毒色胺内盐（2号峰）、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（4 号峰）、木兰花碱（6 号峰）、药根碱（11 号峰）、巴马汀（12 号峰）、小檗碱（13 号峰），见图2。以木兰花碱（6 号峰）作为参照物峰（S），指定其相对峰面积值为1.000，计算指纹图谱中其他共有特征峰的相对峰面积比值，见表2。

图2 小檗皮中各成分色谱图

表2 15 批样品指纹图谱共有峰相对峰面积

2.6.4 相似度评价 将15 批药材的HPLC 指纹图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 年A版）进行相似度评价。结果，除S5 相似度为0.779 外，其余样品均大于0.85，其中鲜黄小檗0.895～0.956，匙叶小檗0.779～0.962，甘肃小檗0.955～0.964，大多数样品相似度较高，表明不同品种之间成分组成相似，见表3。

表3 15 批样品相似度

2.7 模式识别 将15 批样品的13 个共有色谱峰的峰面积导入SIMCA-P 14.1 软件进行模式识别分析，包括PCA 和PLS-DA，数据采用自动规格化处理后，首先用无监督模式识别方法观察样品的自然聚集。模型自动拟合选择了4 个主成分，其累计贡献率为81.4%，表明前4 个成分能反映原始数据81.4%的信息。所有样品的PCA 得分图见图3C，可知3 个基原的小檗皮样品被明显分为3 类。

为进一步验证小檗皮不同品种之间的差异，采用有监督的模式识别方法（PLS-DA）对所有样品进行模式识别分析。结果，PLS-DA 模型参数为R2X ＝76.0%，R2Y ＝97.2%，Q2＝86.6%，表明建立的模型较稳定且预测性良好。PLS-DA 得分图见图3D，可知分类结果与主成分分析结果一致，3 个品种被明显聚集在不同区域。由此表明，各品种之间成分组成存在一定的差异。

3 讨论

3.1 色谱条件优化 考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸流动相系统，结果表明以乙腈-0.2%磷酸洗脱时主要色谱峰的分离度明显提高，且峰形较好，保留时间适中。考察了210、230、256、270、300 nm等不同波长下的吸收图谱，发现在210 nm 波长下色谱峰信息多，峰型良好，吸收较强。此外，还考察了色谱柱、柱温等条件，最终确定为“2.1”项下条件。

图3 15 批小檗皮样品PCA、PLS-DA 分析得分图

3.2 提取条件优化 考察了冷浸、回流、超声3 种不同提取方法，结果表明超声提取效率高。考察了30% 甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇及盐酸-70%甲醇（1∶100），发现70%甲醇提取效果较好，加入1% 盐酸后部分色谱峰峰型改善，提取效率提高。考察了15、30、60 min 提取时间，发现60 min 提取率接近30 min，高于15 min，最终选择超声30 min 提取。考察了20、50、100 mL 提取溶剂用量，发现50 mL 溶剂可充分提取药材中的化学成分，并且各成分在色谱图上具有适合的响应值。

3.3 模式识别分析 本研究采用HPLC 法建立了小檗皮化学指纹图谱，并以6 号峰木兰花碱为参照峰，确定了13 个特征峰，鉴定了其中6 种成分，能全面反映药材内在质量。大部分药材样品的相似度均大于0.85，表明所建立的HPLC 指纹图谱可用于小檗皮质量控制。

15 批样品HPLC 图谱轮廓基本一致，但共有峰峰面积相差较大。因此，在HPLC 指纹图谱的基础上本研究对其进行PCA 和PLS-DA 分析，发现2 种模式识别方法均能很好地区分3 个品种，而以6 种成分含量为指标时不能得到明显的分类。综上所述，HPLC 指纹图谱结合模式识别方法可有效区分小檗皮不同基原品种，表明体现整体性的HPLC 指纹图谱能更好地检测各成分的种间变化，可为该药材基原鉴定和质量控制提供参考。