基于网络药理学探讨生脉散治疗动脉粥样硬化的作用机制

欧阳效强，饶 炼，雷 敏，陈晓坤，洪创雄

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是危害我国全民健康的首要疾病，据推算，目前我国CVD 人数约2.9 亿，CVD 所导致死亡人数占全民疾病死亡人数的40%以上，比肿瘤还高，而且CVD 患病率及死亡率仍然在不断增加［1］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是众多心脑血管疾病形成的主要病理基础之一，因此，有效防治AS 对于预防心脑血管疾病发生发展至关重要。目前，西医降脂、抗血小板聚集等药物虽然能够有效的延缓AS 的发生和发展，但是也存在诸多问题，如调脂药物易导致肝肾功能损害及横纹肌溶解［2］，抗血小板药物容易引起胃肠道不适和出血等［3］。而中医药在治疗动脉粥样硬化方面有独特的优势，中医药能够从整体上调节脏腑功能，延缓疾病进展，改善患者的临床症状，而且毒副作用小［4］。因此，中医药为动脉粥样硬化的防治提供了一个很好的方向。

中医学没有“AS”的病名，但从病因病理、临床症状以及发病部位的不同，临床上常常将冠状动脉粥样硬化，颈动脉硬化，脑动脉硬化归属于“脉痹”“胸痹心痛”“眩晕”“中风”等范畴。目前多数医家认为AS 的基本病机为“本虚标实”，气阴两虚为本，痰、瘀、毒为标，治疗上益气养阴治其本，活血、化痰、解毒治其标［5］，临床有较多医家常以生脉散加减治疗。国医大师邓铁涛教授和陈可冀院士在治疗气阴两虚型冠心病时，常用生脉散加减［6-7］。洪创雄教授多年致力于心血管疾病研究，常以生脉散加减治疗冠心病，临床疗效确切，值得推广。

生脉散出自《医学启源》，由三味药组成（人参、麦冬、五味子）。方中人参甘温补气生津为君；麦冬甘而微寒，养阴生津为臣，五味子味酸而咸，擅长固津摄气为佐，三药合用，一补一润一敛，益气养阴生津，是治疗气阴两虚的经典名方。现代药理研究表明，生脉散具有调节血脂、减轻炎症反应、抗氧化［8］等作用，这为生脉散防治AS 提供了一定的科学依据。同时临床也有较多文献报道生脉散能够用于治疗AS，但大多是从单一个角度去解释其可能作用机制，缺乏系统性研究。而中药成分的复杂性及作用的整体性提示我们，生脉散可能通过多成分、多靶点、整体调节来发挥作用，因此需要我们进行深入系统的研究和探讨。

本研究通过网络药理学方法，构建生脉散-AS-靶点相互关系网络，研究生脉散中多种成分、多个靶点与AS 的相互作用关系，从整体上系统的探讨生脉散治疗AS 的作用机制，并为后续深入开展实验研究和临床应用提供指导。

1 方法

1.1 生脉散活性成分与潜在靶点筛选 首先在中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／ tcmsp.php）分别输入“人参、麦冬、五味子”3 味中药药名，查找三者全部化学成分，筛选条件是化合物口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，然后查找化合物对应的靶点。由于在TCMSP 数据库中没有“麦冬”的相关成分，故通过中医分子机理生物学信息分析工具（BATMAN-TCM，http：／ ／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）进行检索，筛选条件是Score cutoff ≥20、P-value cutoff＜0.05［9］。通过上述2 个数据库检索得到生脉散3 味中药的化合物和靶点，将结果合并，建立生脉散化学成分—靶点数据库。

1.2 AS 疾病靶点的确定 通过TTD 数据库（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）、CTD 数据库（http：／ ／ctdbase.org／）、OMIM 数据库（https：／ ／www.omim.org／）、DisGenet 数据库（http：／ ／disgenet.org／），搜集与AS 相关的靶点。

1.3 成分-靶点网络构建 筛选生脉散活性成分潜在作用靶点及AS 疾病靶点，通过韦恩图取交集得到两者的共同靶点，并进行药物成分靶点-AS 疾病靶点映射，利用Cytoscape3.6.1 软件构建“药物成分-作用靶点”互作网络。药物活性成分和作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将生脉散和AS 共同作用靶点代入STRING（https：／ ／string-db.org／）数据库中，以置信度分数score＞0.9 为条件进行筛选，其余参数不变。将得到的结果以文本形成导入Cytoscape3.6.1 软件，构建PPI 相互作用网络图。

1.5 基因本体（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用David 数据库（https：／ ／david.ncifcrf.GOv／）对生脉散和AS 共同作用靶点蛋白进行GO 功能和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析主要用于描述基因靶点的功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能；KEGG 富集分析可以得到生脉散和AS 共同靶点所富集的信号通路。P＜0.05 表示差异具有统计学意义［10］。

2 结果

2.1 生脉散化合物 在2 个数据库（TCMSP、BATMANTCM）进行检索筛选后，得到人参、麦冬、五味子的有效化合物45 个，其中人参22 个，麦冬18 个，五味子8 个，其中3 个为共有成分，与此对应的化合物预测靶点有418 个。

2.2 AS 疾病靶点 在疾病靶点数据库（TTD、CTD、OMIM 和DisGenet）查找检索AS 的疾病作用靶点，共得到254 个。

2.3 治疗AS 化合物及潜在靶点 利用韦恩图获得生脉散和AS 两者的共同作用靶点46 个，分别对应23 个活性化合物（人参13 个，五味子5 个，麦冬7 个），见图1，化合物见表1。由此可知，生脉散可以通过多种成分作用于AS疾病的多个相关靶点来发挥作用。

图1 生脉散-动脉粥样硬化共同基因靶点

表1 生脉散中23 个化合物

2.4 成分-靶点网络及靶点互作分析 将生脉散活性成分和作用靶点信息导入Cytoscape3.6.1 软件，构建生脉散治疗AS 的“成分-靶点”网络图，共包含72 个节点（23 个成分节点，46 个基因节点，3 个药物节点）、124 条边，见图2。在网络中，一个节点的度（degree）表示网络中和节点相连路线的条数，度值越大则表明该化合物发挥作用的可能性越大，故图1 中度值大于等于5（中位数）的化合物有8 个，分别为羟基苯甲酸（degree ＝23）、山柰酚（degree＝17）、豆甾醇（degree＝12）、麦冬黄烷酮E（degree ＝6）、甲基麦冬黄烷酮B（degree ＝6）、人参皂苷rh2（degree ＝5）、灌木远志酮 A（degree ＝5）、β-谷甾醇（degree＝5），可能是生脉散抗AS 的重要成分。

图2 生脉散化合物-疾病靶点互作网络

2.5 蛋白相互作用（PPI）网络 将46 个共同靶点导入STRING 中，构建生脉散治疗AS 潜在靶点PPI 网络，将结果以文本形式导出，然后导入Cytoscape3.6.1 软件中，利用network analyzer 插件进行网络拓扑分析，得到潜在靶点基因拓扑参数自由度（degree）、介度中心度（betweenness）和接近中心度（closeness），自由度表示节点所包含的边的数目，靶点自由度越大，表明通过该靶点发挥作用的可能性越大。结果，自由度≥15（中位数）的靶点有22 个，具体见表2，相互作用关系见图3。

2.6 GO 功能富集分析 在DAVID 数据库中对生脉散和AS 的共同靶点进行GO 功能富集分析，根据P＜0.05 确定了101 个GO 条目，其中与生物过程（BP）相关的条目73个；与细胞组成（CC）相关的条目7 个，主要涉及细胞外空间、核、质膜外侧、高尔基体、细胞外基质等方面；与分子功能（MF）相关的条目21 个，主要涉及脂质代谢、炎症反应、信号传导、调节胰岛素分泌、血管收缩调节、平滑肌细胞增殖、雌激素、内皮细胞等方面，推测生脉散可能通过调节这些生物过程来起到治疗AS 的作用，具体见表3。

表2 22 个核心靶点

图3 生脉散核心靶点PPI 网络

2.7 KEGG 通路富集分析 通过DAVID 对46 个靶点进行KEGG 通路分析，得到35 条生物学通路，根据P＜0.05 并结合相关文献进行筛选，得到AS 相关通路22 条，具体见表4。

3 讨论

本研究系统分析了生脉散（麦冬、人参、五味子）的有效成分，预测了治疗AS 的相关靶点，构建了生脉散-AS-靶点网络。通过对生脉散-靶点网络分析得出生脉散治疗AS 的主要成分是山柰酚、豆甾醇、麦冬黄烷酮E、甲基麦冬黄烷酮B、人参皂苷rh2、β-谷甾醇等。山柰酚是人参的重要成分，是一种有抗炎、抗氧化、抑制血栓形成和血小板活性等作用的黄酮类化合物［11］；有研究报道山柰酚具有很好的抗炎特性，能够抑制促炎因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放，增加抑炎因子白介素10（IL-10）的表达和分泌［12-13］；山柰酚不仅可以保护低密度脂蛋白免受氧化，还可以通过抑制巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取来预防AS［14］。此外，山柰酚还能抑制凝血酶和FXa 的酶活性，起到抑制血栓形成和血小板活化的作用［15］，而血小板聚集和血栓形成是AS 的发病机制之一，因此有一定的治疗AS 的作用。豆甾醇为人参和麦冬共有成分，它具有抑制血管紧张II 刺激的A7r5 大鼠大动脉血管平滑肌细胞增殖，具有一定的抗AS 的作用［16］。甲基麦冬黄烷酮B 是麦冬的有效成分，能够显著下调促炎因子白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）的表达，起到抗慢性炎症作用［17］。

表3 生脉散-AS-基因的生物学过程

通过对生脉散核心靶点PPI 网络进行拓扑分析，共分析22 个关键靶点，这些靶点涉及脂质代谢、炎症反应、胰岛素分泌、细胞因子、细胞增殖与迁移等生物学过程。通过GO 功能富集分析也提示生脉散治疗AS 涉及上述生物学过程。此外，KEGG 通路富集分析结果显示生脉散可能通过PPAR 信号通路、胰岛素抵抗、TNF 信号通路、核转录因子-κB（NF-κB）信号通路起到治疗AS 的作用。

表4 生脉散-AS-基因通路富集分析（P 值排名前十）

目前认为，炎症反应在AS 病理过程中起着基础性作用［18］。TNF 信号通路、NF-κB 信号通路的激活对促进AS发生发展起着至关重要的作用。TNF-α 是血管内皮细胞损伤或导致血管功能紊乱的重要炎症因子，它可使血管损伤和血栓形成，并能够激活诱导NF-κB 入核，激活NF-κB 信号通路，促进TNF-α、IL-6、IL-8 等炎症因子的释放，从而引起和加重机体炎症反应［19］。有研究显示，生脉散可以降低中暑大鼠血清白介素1β（IL-1β）、IL-6、TNF-α 的水平，预防中暑引起的低血压和脑缺血损害［20］。邢清敏、陆曙等在利用生脉散干预扩张型心肌病大鼠模型的研究中发现，生脉散可通过下调Toll 样受体4（TLR-4）和NF-κB 的基因、蛋白表达，从而抑制TLR-4 ／NF-κB 信号通路，降低炎症因子IL-6、TNF-α 的水平［21］。本研究通过分析，发现TNF 是生脉散和AS 的核心靶点，结合既往研究，生脉散可能通过调控TNF-α 和TNF 信号通路、NF-κB 信号通抑制炎症反应。

胰岛素抵抗和AS 的形成密切相关，机体在发生胰岛素抵抗时，胰岛素信号通路受损引起血管内皮功能紊乱和血管平滑肌细胞增殖和迁移、诱导细胞凋亡［22-23］。而血管内皮功能受损和血管平滑肌细胞迁移增殖是AS 的早期病理表现。吴小慧等实验研究显示生脉散能够降低2 型糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP 等的水平，改善胰岛素抵抗，并能够降低血清血管内皮生长因子（VEGF）水平，起到抗AS 作用［24-25］。结合网络药理学研究，生脉散和AS共同靶点涉及胰岛素抵抗、1 型糖尿病、2 型糖尿病。由此，我们可以推测，生脉散可以通过改善胰岛素抵或通过治疗糖尿病发挥防治AS 的作用。

氧化应激损伤也是AS 发病机制之一，氧化应激能升高氧化低密度脂蛋白水平，促进泡沫细胞形成，损害血管内皮细胞，促进炎症反应和细胞增殖、凋亡，从多个方面参与AS 的发生发展［26］。前期已有研究表明，生脉散提取物能够通过清除过氧化氢（H2O2）、活性氧（ROS）发挥抗氧化应激的作用［27-28］。在慢性间歇性缺氧小鼠模型的实验中也证实了生脉散能降低丙二醛（MDA），增加超氧化物歧化酶（SOD）水平，显示出良好的抗氧化活性［29-30］。也有研究显示，加味生脉散能够延缓家兔AS 斑块的形成，并能够降低甘油三酯（TG）的水平，提示加味生脉散具有调节血脂的作用［31］。

过氧化物酶增殖物激活受体（peroxisome proliferater-activated receptor，PPAR）主要有 PPAR-α、PPAR-β 和PPAR-γ 三种表型，其中PPAR-α、PPAR-γ 与AS 密切相关。研究表明，PPAR-α 和PPAR-γ 的激活能通过抑制血管内皮炎症反应，抑制细胞增殖和迁移，抑制单核细胞转化成泡沫细胞，减少血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达等多个方面，发挥抗AS 的作用［32］。此外激活的PPAR-α 在调节脂肪代谢，尤其是降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的浓度发挥着重要作用［33］。本研究发现，PPAR-α 和PPAR-γ 是生脉散和动脉粥样硬化的共同作用靶点。因此我们推测，生脉散有可能通过调节PPAR 信号通路调节脂质代谢，降低血脂水平，抑制炎症反应、细胞增殖和迁移、单核细胞转化等防治AS。

综上所述，本研究利用网络药理学研究方法，构建了生脉散-AS-靶点互作网络，通过分析得出，生脉散能够通过作用于胰岛素、肿瘤坏死因子等多个靶点，调节胰岛素信号通路，TNF 信号通路、NF-κB 信号通路、PPAR 信号通路等多条途径，发挥改善胰岛素抵抗，抑制炎症反应，调节脂质代谢、抗氧化应激等作用来防治动脉粥样硬化。该研究从整体水平，预测和分析了生脉散治疗动脉粥样硬化的作用机制，对于后续研究提供了很好的指导。