基于网络药理学研究脑血疏口服液治疗脑出血的作用机制

张友刚 李昊楠史永平 张姗姗李晓彬曾英姿韩利文田青平∗刘可春

［1.山西医科大学药学院，山西太原 030001；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）， 山东省科学院生物研究所，山东济南 250103；3.山东沃华医药科技股份有限公司，山东潍坊 261205；4.山东第一医科大学药学与制药科学学院，山东济南250001］

脑出血（cerebral hemorrhage，CH）是一种常见的脑血管疾病，其通常是由脑内血管发生病变、坏死、破损引起，大多数患者不是由于脑出血导致原有病情加重，而是由于脑出血引起的一系列生理病理变化致残致死［1-2］。脑出血一般发病较为突然，若不及时治疗，轻则使患者留下后遗症，重则导致患者死亡［3］。脑出血在临床上病死率极高，受到了医药部门的高度重视，临床上对于脑出血的治疗包括西医治疗、中医治疗、中西医结合治疗，其中以中西医结合治疗的效果最佳。脑出血是影响我国国民健康的重大公共卫生问题，防治脑出血的发生、发展十分重要。

中医认为，脑出血为“瘀血阻滞，脉道不利”，治疗上多采用活血化瘀的方法［4］。脑血疏口服液是我国国家中药保护品种，具有益气、活血、化癖，通腑的功效［5］。脑血疏口服液由黄芪、大黄、牛膝、牡丹皮、石菖蒲、川芎、水蛭7 味中药制成，是唯一一个治疗脑出血的中成药。临床实验表明脑血疏口服液可以显著加快血肿吸收、具有显著改善神经功能受损和临床综合症状的作用，对于脑出血患者的急性期和康复期具有良好的疗效。中药复方成分复杂，这种复杂性使得中药复方的药效物质基础和作用机制不明确［6］。网络药理学是基于网络生物学和系统生物学开发的一门新兴学科，随着与网络药理学相关的多学科的快速发展，国内外越来越多的学者运用网络药理学来探索疾病与药物更深层次的关联［7］。本研究利用网络药理学技术发掘脑血疏口服液治疗脑出血的机理，通过建立“药效成分-靶标-通路”网络模型，深入探讨脑血疏口服液治疗脑出血的药效物质、作用机制，为中药现代化研究提供参考。

1 方法

1.1 脑血疏口服液化学成分信息的收集 通过TCMSP（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／index.php）及文献收集脑血疏口服液7 味中药（黄芪、大黄、牛膝、牡丹皮、石菖蒲、川芎、水蛭）的全部化学成分，并通过TCMSP、Pubchem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）以及查阅相关文献获得这些成分的化学结构，并保存Smiles 格式。

1.2 活性成分的筛选 口服吸收利用度（OB／%）和药物相似性（DL）是药物筛选过程中两个重要的ADME 参数，常用于评价化合物的成药性［8］。本研究选取同时满足OB≥30%、DL≥0.18 的化合物作为潜在活性成分，结合相关文献报道，对水蛭中不满足以上2 个条件的活性成分也进行收录［9］。

1.3 成分靶点的筛选、疾病靶标的收集 Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）服务器是基于分子的二维和三维结构与已知蛋白分子的作用程度来预测化合物的潜在靶标，从而精准的得到未知化合物的作用靶标［10］。将筛选得到的潜在活性分子的Smiles 结构导入该数据库，并选定研究物种为人类（homo sapiens），导出潜在化学成分的靶标。以“cerebral hemorrhage”为关键词，检索GeneCards（https：／ ／www.genecards.org）数据库、DisGeNET（http：／ ／www.disgenet.org／search）数据库中脑出血相关基因，并去除重复基因。

1.4 “单味药-活性成分-作用靶点”网络的构建 根据以上预测结果，采用Cytoscape3.7.1 软件构建“单味药-活性成分-作用靶点”关系网络模型，节点（node）代表单味药、潜在活性成分与潜在作用靶点，边（edge）用来连接单味药与活性成分、活性成分与作用靶点，展现单味药-活性成分-作用靶点之间的联系。

1.5 交集基因的获取及其蛋白质相互作用网络的构建 将脑血疏口服液作用靶点基因和脑出血的相关基因分别输入在线韦恩图绘制网站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）获取交集基因，交集基因即为脑血疏口服液治疗脑出血的潜在靶点。将获取的交集基因导入String 数据库（https：／ ／string-db.org／），然后将获取的交集基因信息导入Cytoscape 3.7.1 绘制交集基因蛋白质相互作用网络。

1.6 交集基因的生物分子功能注释 将获取的交集基因靶点信息采用 David6.8 数据库（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）进行GO 注释分析和KEGG 通路分析。其中GO 注释分析分为3 个部分，分别为生物过程分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）和生物过程（biological process，BP）。利用David6.8 数据库（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）进行通路富集分析，将通路富集分析的结果通过Omicshare（http：／ ／www.omicshare.com／tools／index.php／）对富集分析结果进行可视化处理。

1.7 主要活性成分-靶点分子对接 LeDock 是苏黎世大学赵洪桃在博士期间开发的一款跨平台分子对接软件，在速度和准确度上均呈现出强劲的优势［11］，它采用遗传算法和模拟退火算法相结合的方法对配体的构象进行取样［12］，其蛋白处理过程十分方便，可实现水分子、杂原子、离子的去除，同时氢原子也可以自动加上。将“1.6”项下的主要活性成分通过Chem3D Pro 14.0 得到其MOL2 格式，通过Uniprot（https：／ ／www.uniprot.org／）、RCSBPDB（http：／ ／www.rcsb.org／）数据库获取主要活性成分作用于疾病靶点的PDB 蛋白晶体，并保存为PDB 格式，为分子对接做好前期准备。将靶点蛋白晶体及对应的配体先后导入LeDock 进行分子对接，保存对接后产生的DOK 文件用于展示对接结果。

2 结果

2.1 脑血疏口服液7 味中药潜在活性成分及脑出血相关靶点 在TCMSP 数据库中筛选出潜在活性成分，分别为黄芪20 种，石菖蒲4 种，牛膝20 种，牡丹皮11 种，大黄16 种，川芎7 种，合并去重后得到70 种，再查阅文献发现水蛭45 种潜在活性成分，最终得到115 种，具体见表1。通过DisGeNET 数据库搜集到疾病靶标66 个，在Genecards数据库以Relevance score 的中位数的2 倍为卡值，获得647 个疾病靶标，将2 个数据库的疾病靶标去重，最终得到656 个。

2.2 “单味药-活性成分-作用靶点”网络 将单味药-活性成分信息、活性成分作用靶点信息导入Cytoscape 3.7.1，采用Merge 工具绘制“单味药-活性成分-作用靶点”图，见图1，一共有561 个节点、1 833 条边。通过Network Analyzer 计算网络拓扑参数，发现潜在成分作用靶点Degree值（网络模型中每个节点与其相连节点的数目）＞20 的有15 个，排名前5 的是TDP1、MAPT、CYP19A、MBNL、CA1，分别有69、57、26、26、24 个化合物与其发生相互作用。

2.3 交集基因及蛋白质相互作用网络 通过在线韦恩图，得到脑血疏口服液潜在活性成分作用靶点与脑出血疾病作用靶点的交集基因有66 个，见图2。将其导入String 数据库，经Cytoscape 3.7.1 处理后得到蛋白质相互作用图，见图3，包括66 个节点、和595 条边，平均节点度值为18.03。

表1 脑血疏口服液中7 味中药潜在活性成分

续表1

图1 脑血疏口服液成分靶点网络

图2 脑血疏口服液成分靶点韦恩图

图3 交集基因蛋白质相互作用

2.4 生物功能通路分析 将66 个基因导入David 数据库进行GO 分析，以P＜0.01、错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05 为标准进行筛选，结果见图4。由此可知，从生物过程层面上看，脑血疏口服液对蛋白质自磷酸化、平滑肌细胞增殖的正调控、肽基酪氨酸磷酸化、对脂多糖的反应、磷脂酰肌醇介导的信号传导、血管生成、细胞增殖的正调控等影响较大；从细胞组分层面上看，脑血疏口服液对质膜、细胞表面、受体复合物、膜筏、胞质溶胶、细胞外间隙等影响较大；从分子功能层面上看，脑血疏口服液对酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、相同的蛋白质结合、丝氨酸型内肽酶活性、四氢生物蝶呤结合、血红素结合等影响较大。前20 条通路见图5。

图4 脑血疏口服液治疗脑出血候选靶点的GO 富集分析

图5 KEGG 分析

2.5 脑血疏口服液活性成分-靶点-通路网络模型 将富集分析排名前20 的通路所对应的脑血疏口服液潜在活性成分和作用靶点构建“活性成分-靶点-通路”网络模型，见图6，包括116 个节点、366 条边。由此可知，ESR1、AKT1、AKT3、EGFR、PIK3CA 节点度值排名靠前，可能是脑血疏口服液治疗脑出血的核心靶点。

2.6 分子对接 将活性成分-靶点-通路网络中排名前五的化合物与其作用于脑出血的靶点进行分子对接，结果见表2，可知槲皮素与基质金属蛋白酶3（MMP3）具有较好的结合活性，大部分活性成分与其作用的治疗脑出血的靶点具有良好的结合性能。再将已知的能特定作用于MMP3 的抑制剂伊洛马司他（Ilomastat，PubChem CID：132519）与1HY7 进行分子对接，其结合能为-10.39 kcal／mol。另外，槲皮素、伊洛马司他都是通过疏水相互作用、氢键、配位键与1HY7 相互作用，以PyMol V1.8 和Ligplot+V2.1 展示对接结果，见图7。

图6 脑血疏口服液治疗脑出血活性成分-靶点-通路网络

表2 脑血疏口服液主要活性成分-作用靶点分子对接结果

图7 1HY7 与槲皮素、伊洛马司他的分子对接

3 讨论

脑出血是指非外伤性脑内实质出血，脑出血后脑组织会发生一系列病理生理变化，分为原发性损伤和继发性损伤，前者包括血肿增大、血肿机械压迫，后者包括血红蛋白毒性作用、炎性反应、凝血酶释放、局部脑组织血流量减少等［13］。脑出血治疗早期以消除血肿为主要治疗目的，后期以继发性损伤中的炎症损伤为主［14-15］。

本研究系统分析了脑血疏口服液的有效成分，构建了化合物-靶点-通路网络，在该网络中起关键作用的是黄芪紫檀烷苷、槲皮素、汉黄芩素、川芎嗪、桉脂素等。在脑部血管的修复过程中，血管内皮祖细胞起着关键的作用。血管内皮祖细胞源于骨髓，被释放至外周血液后根据需要可以分化成各种细胞，当分化成内皮细胞可以促进血管的新生以及内皮破损的修复在各种病理和组织工程学领域有广泛应用［16-17］。孙军［18］等研究表明，槲皮素能够刺激血管内皮祖细胞的增殖与分化，从而促进损伤血管的修复。川芎嗪能够保护受损的血管内皮细胞，且在一定浓度范围内呈现出剂量依赖［19］。除此之外，川芎嗪具有较强的抗血小板作用，和一定的抗血栓作用［20］。川芎嗪可能通过抑制血小板聚集、降低血液黏滞度、改善脑部血管循环，从而达到避免脑部组织缺血缺氧的目的。脑出血后，缺血中心区将发生不可逆性的神经损伤，而缺血半暗带发生的神经元细胞凋亡是可逆的［21］。汉黄芩素通过抑制小胶质细胞的炎症激活来保护神经元细胞，而不直接作用于神经元细胞［22］。上述文献报道与本研究通过网络药理学预测的槲皮素、川芎嗪、汉黄芩素可能的活性作用一致。除此之外，存在一些未被报道的活性成分，将成为未来研究脑出血治疗脑出血的潜在方向，如黄芪紫檀烷苷、桉脂素等。

脑血疏口服液治疗脑出血涉及多个靶点，成分-靶点-通路网络提示，ESR1、AKT1、PIK3CA、AKT3、EGFR、PTGS2、MMP2、MMP3 等靶点在治疗脑出血的过程中发挥着重要的作用。苏氨酸蛋白激酶AKT1 和AKT3 能够激活PI3K-Akt 信号通路，从而促进脑出血后局部脑组织缺血造成的损伤神经干细胞的增殖［23］。MMP2 和MMP3 同属MMPs，二者的激活能够诱发脑出血后炎症反应的发生，炎症反应导致血脑屏障的破坏以及脑部神经功能的损伤，抑制MMPs 的过表达能够起到保护血脑屏障及脑部神经的作用［24］。除此之外，成分-靶点-通路网络揭示了诸如PTGS2、NOS2、NOS3 等炎症相关的靶点在治疗脑出血时的重要性。在分子对接验证过程中发现，槲皮素和伊洛马司他与1HY7具有较好的结合能力，两者结合位点相同，而且都能够与MMP3 中的锌形成配位键，抑制MMP3 的表达，从而验证了靶点预测的可靠性。

本研究将所得到的靶点进行KEGG 通路分析得到与脑出血可能相关的通路，如PI3K-Akt、肿瘤坏死因子（TNF）、低氧诱导因子-1（HIF-1）、细胞凋亡（apoptosis）、ErbB、Rap1 信号通路等，与炎症、代谢、血脑屏障功能、神经元保护及细胞凋亡密切相关。脑出血后，由于血肿等原因致使局部组织血流量减少，缺血部位组织细胞就会处于低氧状态。HIF-1 信号通路的激活在缺血后细胞代谢中的作用发挥着重要的作用，参与重建细胞代谢途径来实现对脑组织的保护［25］。脑出血患者发病几天后血肿程度与TNF-α 水平呈正相关［26］，其高表达是血脑屏障破损、炎症反应、神经细胞凋亡等继发性损伤的重要原因［15］。脑血疏口服液活性成分可能通过作用于TNF 信号通路相关靶点，抑制TNF-α 的过表达，从而达到保护血脑屏障、减少神经细胞的凋亡等目的。

综上所述，脑血疏口服液通过多成分作用于多靶点，从而协同调控多种通路，从整体网络层面发挥抗脑出血作用，展现了传统中药有别于小分子化药的作用特点。关于脑血疏的关键活性化合物、作用靶点和通路还需要深入的验证研究，为今后临床治疗提供理论依据。