和厚朴酚抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制

陈佳权，赵 欢，武晓萌，尹洪丽，艾恒玲∗

（1.牡丹江医学院附属第二医院妇产科，黑龙江牡丹江 157000；2.牡丹江医学院附属第二医院药剂科，黑龙江牡丹江 157000；3.上海市徐汇区中心医院妇科，上海 200030）

和厚朴酚（Honokiol）是一种从木兰属植物的叶和树皮中分离得到的酚类天然化合物，其对多种癌症均具有治疗作用而被广泛研究［1-2］。自古至今，大量研究报道，和厚朴酚在宫颈癌中具有治疗作用［3］，但是其治疗作用的机制尚未完全明白。血小板反应蛋白2（Thrombospondin-2，THBS2）在癌症的发生发展中具有重要作用［4］，其中包括宫颈癌。但是，和厚朴酚在宫颈癌中的作用与THBS2 的关系尚未清楚。黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）为是生长因子受体和整合素介导的信号的关键调控因子，通过其激酶活性调控正常细胞和癌细胞的基本过程［5］。FAK的表达和活性增加发生在许多原发性和转移性癌症中，并且与较差的临床预后相关［6］。但是，和厚朴酚、THBS2 在宫颈癌中的作用是否与该通路相关，尚未有研究报道。本研究拟以宫颈癌细胞siha 为研究对象，观察和厚朴酚、THBS2 对其增殖、迁移和侵袭的影响，揭示其作用机制与FAK 信号通路相关，为和厚朴酚作为抗癌药的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞siha 购自美国ATCC 公司（BNCC252935）；和厚朴酚（99.9%）购自西安昊轩公司（批号20170203）；DMEM 培养基（批号20150523）、胎牛血清（批号20150521）、MTT（批号20150623）、胰蛋白酶（批号20150712）均购自美国Sellect 公司；LipofectamineTM2000（批号20160103）、BCA 蛋白定量试剂盒（批号20160206）、逆转录试剂盒（批号20160305）购自大连Takara 公司；SDS-PAGE 试剂盒（P0012A）、ECL 发光液（批号20160405）和RIPA 蛋白裂解液（批号20160412）均购自碧云天生物技术公司；Matrigel 基质胶（批号20151203）、Transwell 小室（批号20151105）购自美国Corning 公司；兔抗人 THBS2（sc-133061）、FAK（sc-271126）、MMP-9（sc-21736）抗体购自美国Santa Cruz 公司；HRP 标记的山羊抗兔二抗（ab171522）购自美国Abcam 公司；Trizol 试剂购自北京全式金生物技术有限公司（批号20161002）；反转录（批号20160926）与实时荧光定量PCR 试剂盒（批号20160815）购自北京天根生化科技有限公司。凝胶电泳仪器DYCZ-24DN 购自北京海天友诚科技有限公司；Molecular Devices 酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司；X71 倒置相差显微镜购自日本奥林巴斯公司；7500 型荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将宫颈癌细胞siha 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化约1 min，按照1∶3 的比例更换培养基，每2 d 传代一次。

1.2.2 细胞转染与分组 将和厚朴酚（5、10、15 μg／mL）处理siha 细胞48 h 分别标记为5 μg／mL 组、10 μg／mL组、15 μg／mL 组。将正常培养的siha 细胞标记为对照组。将pcDNA 组（转染pcDNA）、pcDNA-THBS2 组（转染pcDNA-THBS2）、和厚朴酚+pcDNA 组（转染pcDNA并用和厚朴酚处理）、和厚朴酚+pcDNA-FAK 组（转染pcDNA-FAK 并用和厚朴酚处理），用脂质体LipofectamineTM2000 转染至siha 细胞，转染6 h 后，更换新鲜培养液继续培养48 h，检测转染效率，转染成功后用于后续试验。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测THBS2、FAK mRNA 表达 收集对照组、5 μg／mL 组、10 μg／mL组、15 μg／mL 组、pcDNA 组、pcDNA-THBS2 组siha 细胞，采用Trizol 法提取细胞中的总RNA，应用Nanodrop2000c 超微量分光光度计检测RNA 浓度。参照反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录合成cDNA。THBS2 正向引物5′-ACTGCCAGCTCCTCTTCAAT-3′，反向引物5′-CATCAATGTCCACGGAGCAG-3′；FAK 正向引物5′-CACGGAATCATGCCAGACAG-3′，反向引物5′-TCATCAACCA CTGGCTGTC T-3′；GAPDH 正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTG ATG GGATT-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA 为模板进行qRT-PCR 实验，参照实时荧光定量PCR 试剂盒配置反应体系，反应条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 次循环，THBS2、FAK 均以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算THBS2、FAK mRNA 相对表达量。

1.2.4 MTT 法检测细胞抑制率 取适量“1.2.2”项下各组细胞，加入20 μL 5 g／L MTT 溶液，培养4 h，然后弃去上清，每孔加入150 μL DMSO 振荡使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度（A）。细胞抑制率＝ ［1-A490样品／A490对照］×100%。

1.2.5 Transwell 法检测细胞迁移和侵袭 将Transwell 小室置于孔上，放入细胞培养箱平衡30 min。然后将各组细胞消化，用纯RPMI 1640 培养基配制成5×105／mL 细胞悬液。每个小室加入200 μL 细胞悬液，即每孔细胞约为1×105个。每组设置3 个复孔，将24 孔板放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h 后取出上腔，棉签擦去上室膜上未迁移的细胞，PBS 洗涤2 次，甲醇固定30 min，自然晾干后用1 g／L 结晶紫染液染色20 min，弃染液，双蒸水洗2 次，取出后于倒置显微镜下观察拍照（400 倍），计数上、下、左、右、中5 个视野的总细胞数取平均值。

将转染成功的对数期细胞进行Transwell 侵袭实验。基质胶和培养基按1∶8比例稀释后（60 μL）铺于培养小室上，风干后备用，其他步骤同Transwell 体外迁移实验。

1.2.6 Western blot 检测细胞中THBS2、FAK、MMP-9 蛋白表达 收集细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r／min 离心10 min，取上清置于EP 管中，加入5×SDS 上样缓冲液，沸水煮沸10 min，电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜，洗膜，加Ⅱ抗，4 ℃处理2 h，加发光液曝光。

1.2.7 统计学处理 采用SPSS 21.0 软件进行分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 和厚朴酚对宫颈癌细胞的抑制作用 如表1 所示，与对照组比较，10、15 μg／mL 组siha 细胞的抑制率均升高（P＜0.05）。

表1 和厚朴酚对宫颈癌细胞抑制率的影响（， n＝9）

表1 和厚朴酚对宫颈癌细胞抑制率的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05。

2.2 和厚朴酚对宫颈癌细胞迁移侵袭的影响 如图1、表2 所示，与对照组比较，和厚朴酚10、15 μg／mL 组siha 细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均减少，MMP-9 蛋白表达量降低（P＜0.05）。

图1 和厚朴酚对宫颈癌细胞迁移及侵袭的影响

表2 和厚朴酚对宫颈癌细胞迁移侵袭的影响（， n＝9）

表2 和厚朴酚对宫颈癌细胞迁移侵袭的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05。

2.3 和厚朴酚对宫颈癌细胞中THBS2 表达的影响 如图2、表3 所示，与对照组比较，和厚朴酚10、15 μg／mL 组siha 细胞中THBS2 mRNA 和蛋白表达均升高（P＜0.05）。

图2 和厚朴酚处理的宫颈癌细胞中THBS2 的蛋白表达

表3 和厚朴酚对宫颈癌细胞中THBS2 表达的影响（，n＝9）

表3 和厚朴酚对宫颈癌细胞中THBS2 表达的影响（，n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05。

2.4 过表达THBS2 对宫颈癌细胞增殖迁移侵袭的影响 如图3、表4 所示，与pcDNA 组比较，pcDNA-THBS2 组siha细胞的抑制率升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均降低，MMP-9 蛋白表达降低（P＜0.05）。

图3 过表达THBS2 对宫颈癌细胞迁移及侵袭的影响

表4 过表达THBS2 对宫颈癌细胞增殖迁移侵袭的影响（， n＝9）

表4 过表达THBS2 对宫颈癌细胞增殖迁移侵袭的影响（， n＝9）

注：与pcDNA 组比较，∗P＜0.05。

图4 和厚朴酚处理、过表达THBS2 的宫颈癌细胞中THBS2、FAK 的蛋白表达

2.5 和厚朴酚、过表达THBS2 对宫颈癌细胞中FAK 信号通路的影响 用10 μg／mL 和厚朴酚处理后的siha 细胞标记为honokiol 组。如图4、表5 所示，与对照组比较，honokiol 组siha 细胞中THBS2 蛋白表达升高，FAK mRNA、蛋白表达均升高；与pcDNA 组比较，pcDNA-THBS2 组siha细胞中THBS2 蛋白表达升高，FAK mRNA 和蛋白表达均升高（P＜0.05）。

表5 和厚朴酚、过表达THBS2 对宫颈癌细胞中FAK 信号通路的影响（， n＝9）

表5 和厚朴酚、过表达THBS2 对宫颈癌细胞中FAK 信号通路的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0. 05；与pcDNA 组比较，#P＜0.05。

2.6 过表达FAK 逆转和厚朴酚对宫颈癌细胞增殖迁移侵袭的抑制作用 如图5、表6 所示，与和厚朴酚+pcDNA 组比较，和厚朴酚+pcDNA-FAK 组siha 细胞中FAK、MMP-9的蛋白表达均升高，THBS2 蛋白表达、细胞抑制率降低，迁移细胞数、侵袭细胞数均升高（P＜0.05）。

图5 过表达FAK 逆转和厚朴酚对宫颈癌细胞迁移及侵袭的抑制作用

表6 过表达FAK 逆转和厚朴酚对宫颈癌细胞迁移及侵袭的抑制作用（， n＝9）

表6 过表达FAK 逆转和厚朴酚对宫颈癌细胞迁移及侵袭的抑制作用（， n＝9）

注：与和厚朴酚+pcDNA 组比较，∗P＜0.05。

3 讨论

和厚朴酚是中国传统药物厚朴中分离的化学式为C18H18O2的一种化合物，其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化的功效［7-8］。和厚朴酚在肿瘤中的功能及机制研究受到关注。Banik 等［9］报道，和厚朴酚可有效地预防多种肿瘤的生长，如乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等。最近的研究表明，这种植物化学物质可调节各种分子靶点，其可单独使用或与其他化学治疗药物组合用于预防和治疗癌症。自古至今，大量研究报道，和厚朴酚在宫颈癌中具有治疗作用［10］。和厚朴酚在宫颈癌中的作用机制有调控miRNA、p38 信号通路［11］。本研究运用MTT 法、Transwell法检测了和厚朴酚治疗的宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭发现，和厚朴酚可呈浓度依赖性抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，最适浓度为10 μg／mL，这些结果均与前人所作的实验结果相一致；深入研究发现，和厚朴酚可上调宫颈癌细胞中THBS2 的表达，这是国内外首次发现，和厚朴酚的作用机制可能与调控THBS2 的表达相关，这为和厚朴酚的临床治疗的应用提供了理论参考。

THBS2 在多种晚期癌症中出现异常表达，尤其宫颈癌。Zhou 等［12］在研究中报道，THBS2 在宫颈癌组织和细胞中的表达明显下调，且其为miR-20a 的靶标，THBS2 的敲减可消除宫颈癌细胞中miR-20a 抑制剂介导的抗增殖、促凋亡和抗自噬作用。Wei 等［13］、Wu 等［14］在宫颈癌的研究中发现，THBS2 可被miR-221-3p 直接靶向负调控，进而参与宫颈癌或宫颈鳞癌的转移和血管生成。本研究结果发现，THBS2 在和厚朴酚治疗的宫颈癌细胞中表现出明显的上调，并且过表达THBS2 具有与和厚朴酚相同的抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，这说明THBS2 在宫颈癌中具有抑制癌症进一步恶化的作用，并且和厚朴酚可增强这种作用。重要的是，我们发现，和厚朴酚或过表达THBS2均可抑制宫颈癌中FAK 信号通路的活性，推测该通路可能参与宫颈癌的恶性化进展。

FAK 信号通路可整合多条下游信号通路，包括FAKPI3K、FAK-MAPK、FAK-GTPase、FAK-p53 等，其在肿瘤的恶性化进展中具有重要的作用［15-16］报道，纤维连接蛋白可通过激活FAK 信号通路促进宫颈癌的发生发展。Zhou等［17］、郝臻凤等［18］报道，FAK 在宫颈癌中的表达显著升高，并与宫颈癌的分期、浸润、转移程度呈正相关。本研究的结果发现，和厚朴酚治疗、过表达THBS2 在宫颈癌中具有相同的失活FAK 信号通路的作用，并且过表达FAK的宫颈癌细胞中，THBS2 表达明显下调，宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均得到增强，这说明不仅和厚朴酚联合THBS2 可失活FAK 信号通路，相反，FAK 信号通路也可逆向调控和厚朴酚联合THBS2 的抗宫颈癌作用，揭示了和厚朴酚联合THBS2 的抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用可能与失活FAK 信号通路密切相关。

综上所述，和厚朴酚联合THBS2 可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与失活FAK 信号通路有关，为和厚朴酚用于宫颈癌的治疗提供更多依据。