虎杖总蒽醌对肺间质纤维化大鼠上皮间质转化过程中TGFβ1-smad 信号通路的影响

黄 莺，徐 芳

（武汉市第一医院呼吸内科，湖北武汉 430022）

肺间质纤维化是由多种原因引起的肺间质炎症性疾病，病变主要累及肺间质［1］，也可累及肺泡上皮细胞及肺血管，是许多间质性肺疾病的最终病理表现，也是目前肺纤维化的一个主要发病特点及病变部位。其发病机制尚未确定，研究表明，可能与环境、粉尘接触、吸烟、年龄及服用某些药物等有关［2-3］。近年来，上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）已被众多研究者认为是成纤维细胞的重要来源［4］，而与EMT 的发生密切相关的TGF-β1-Samd 信号通路已成为目前研究的重要聚点。研究证实Samd3 的缺失或减少可使TGF-β1 出现功能性减弱，对纤维化的发生有很好的拮抗作用［5］。有研究者发现虎杖流浸膏可有效抑制肺纤维大鼠肺组织中TGF-β1的表达强度，但具体作用蛋白尚未定论，本研究前期发现虎杖水提物对A549 细胞TGF-β1-Samd 信号通路下游部分因子有很好的调控作用，此次研究选取虎杖中活性成分总蒽醌为研究对象，利用中医药靶点丰富、副作用少、适用于临床的优势分析探讨对肺间质纤维化大鼠模型中TGFβ1-Samd 信号的干预作用［6-7］，并用Smad3 siRNA 阻断TGFβ1-Smad 信号通路及Smad3 蛋白抑制剂进行干预，探索Taopc 治疗肺纤维化的作用机制，为肺纤维化的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF 级雄性SD 大鼠60 只，购自济南朋悦实验大鼠繁育有限公司，动物生产许可证号SCXK（鲁）20140007。博来霉素（哈尔滨博莱制药有限公司，批号20170411）；Smad3 抑制剂（杭州联科生物技术股份有限公司，批号20170516）；虎杖总蒽醌（宝鸡市辰光生物科技有限公司，质量分数47.82%）；TGF-β、Smad3、a-SMA、CTGF、E-CAD 基因引物、Smad3 siRNA 质粒构建均由上海生工生物工程有限公司合成；CDNA 试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR 试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；HYP、TNF-α、VEGF、MMP-2、间质胶原蛋白Ⅰ、间质胶原蛋白Ⅲ试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号E20170721A、E20170727A、E20170618A、E20170604A、E201700803A、E20170620A）；CS-6400 全自动生化分析仪（迪瑞医疗科技股份有限公司）。

1.2 分组与给药 参考文献［8-9］报道的方法。取大鼠50 只，适应性喂养1 周后随机分为空白组、博来霉素组、虎杖总蒽醌组、Smad3 siRNA 基因沉默大鼠+虎杖总蒽醌组、Smad3 抑制剂+虎杖总蒽醌组，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，颈部切开皮肤脱毛并剥离出气管，注射BLM 10 mg／kg，空白组给予同等剂量生理盐水。造模后次日，虎杖总蒽醌组给予虎杖总蒽醌（400 mg／kg）灌胃，Smad3 siRNA+虎杖总蒽醌组给予虎杖总蒽醌灌胃并尾静脉注射Smad3 siRNA 质粒（3 mL／kg），Smad3 抑制剂+虎杖总蒽醌组给予Taopc 灌胃于腹腔注射SIS3（2 mg／kg），空白组灌胃给予同等剂量生理盐水，连续4 周。取右肺，RT-PCR 检测肺组织匀浆中上皮细胞标志物（E-cad）、间皮细胞标志物（α-SMA）及信号通路相关分子Smad3、TGFβ1、CTGF的mRNA 的蛋白表达变化。取左肺组织匀浆后离心，碱裂解法检测肺组织HYP 水平，摘眼球取血后离心，酶联免疫吸附法检测血清TNF-α、VEGF、MMP-2、间质胶原蛋白Ⅰ、间质胶原蛋白Ⅲ的水平。

1.3 指标检测

1.3.1 血清指标 于96 孔板上设置标准孔，加入标准液，除标准孔外依次加入待检标本、稀释液封板，室温或37 ℃下孵育1 h，弃去液体，于洗板机上清洗3 次，加入封闭缓冲液室温或孵育30 min 避光，随后加入底物显色孵育30 min后加入终止液，450 nm 波长下检测吸光度值。

1.3.2 RT-PCR Real-time PCR 法检测TGF-β1、Smad3、α-SMA、CTGF、E-cadmRNA 表达。取肺组织适量，研磨并加入1 mL Trizol 混合均匀，提取上层RNA 溶解物后测浓度。取总RNA 2μg 进行逆转录，反应条件为37 ℃反转录15 min，85 ℃，5 s，合成cDNA，PCR 引物序列见表1。PCR 扩增反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃，15 s，60 ℃退火延伸45 s 采集信号，重复40 个循环。每个组别做3 次定量检测，采用公式Q＝2-ΔΔCt，GAPDH 为内参，计算mRNA 相对表达量。

表1 引物序列

1.4 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，组间比较根据方差是否齐性，采用LSD法或Games-Howell 法；等级资料组间比较采用Ridit 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织E-cad、TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGFmRNA 水平 与空白组比较，博来霉素组大鼠肺组织E-cad水平降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平升高（P＜0.05）；与博来霉素组比较，虎杖总蒽醌组大鼠肺组织E-cad 水平升高（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平降低（P＜0.05）；与虎杖总蒽醌组比较，SiRNA+虎杖总蒽醌组、Smad3 抑制剂+虎杖总蒽醌组大鼠肺组织E-cad 水平降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肺组织E-cad、 TGF-β1、 Smad3、 a-SMA、 CTGF mRNA 水平比较（， n＝10）

表2 各组大鼠肺组织E-cad、 TGF-β1、 Smad3、 a-SMA、 CTGF mRNA 水平比较（， n＝10）

注：与博来霉素组比较，∗P＜0. 05；与空白组比较，△P＜0. 05；与虎杖总蒽醌组比较，#P＜0.05。

2.2 大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平 博来霉素组大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平高于空白组（P＜0.05）；与博来霉素组比较，虎杖总蒽醌组大鼠血清TNFα、VEGF、MMP-2 水平降低（P＜0.05）；与虎杖总蒽醌组比较，SiRNA+虎杖总蒽醌组、Smad3 抑制剂+虎杖总蒽醌组大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平升高（P＜0.05）。见表3。

2.3 各组大鼠肺组织HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平 博来霉素组大鼠肺组织HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平高于空白组（P＜0.05）；与博来霉素组比较，虎杖总蒽醌组大鼠肺组织HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平降低（P＜0.05）；与虎杖总蒽醌组比较，SiRNA+虎杖总蒽醌组、Smad3 抑制剂+虎杖总蒽醌组大鼠肺组织HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平升高（P＜0.05）。见表4。

表3 各组大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平比较（， n＝10）

表3 各组大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平比较（， n＝10）

注：与博来霉素组比较，∗P＜0. 05；与空白组比较，△P＜0. 05；与虎杖总蒽醌组比较，#P＜0.05。

表4 各组大鼠肺组织HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平比较（， n＝10）

表4 各组大鼠肺组织HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平比较（， n＝10）

注：与博来霉素组比较，∗P＜0. 05；与空白组比较，△P＜0. 05；与虎杖总蒽醌组比较，#P＜0.05。

3 讨论

上皮-间质转化（EMT）是具有极性的上皮细胞转化为具有运动能力的间质细胞过程，在肺间质纤维化过程中占据重要地位，也是肺纤维化疾病发展的最终方向［10］。研究发现，细胞外信号可通过作用多条信号通路途径导致肺纤维化的产生，进而产生肺间质纤维化，而与EMT 发生相关的信号通路主要包括TGF-β 信号通路、PI3K-AKT-mTOR 信号通路、Wnt 信号通路、MAPK 信号通路及NF-κB 信号通路等，以上通路中TGF-β 信号通路与EMT 的发生关系最为密切，可诱导多种上皮细胞EMT，被认为是各器官纤维化发生的总开关（包括肺纤维化）［11］。近年来，关于TGF-β信号通路在肺纤维化疾病中的研究多集中于TGFβ1-smad信号通路的研究，目前众多被研究药物多通过调控TGFβ1／Smad 直接或间接抑制成纤维细胞的增殖，减轻肺组织ECM 的生成和沉积，达到治疗肺纤维化疾病的目的［12］。TGFβ1 是TGF-β 家族中水平最丰富的一种调控因子，生物作用广泛，具有促进胶原分泌，促进纤维化细胞增殖，增加蛋白酶抑制物水平，增加ECM 沉积等作用，在肺纤维化过程中具有重要作用［5］。TGF-β 通过与受体结合将信号传导至下游Smads 家族，具体传递过程为TGF-β1 首先与TGF-βRⅡ二聚体结合，形成复合物，再结合TGF-βRⅠ二聚体形成异四倍体，使TGF-βRⅠ的GS 区被磷酸化激活，而TGF-βRⅠ磷酸化激活Smad2 和Smad3，磷酸化的Smad2或Smad3 结合Smad4 形成低聚体复合物，转移到细胞核内参与调节目的基因的转录反应，导致细胞内外纤维发生蛋白的表达增加，加速纤维化的进展。因此，对TGF-β1／Smads 信号通路的研究，对于预防及治疗肺纤维化性疾病具有重要意义。

肺纤维化的发病过程中，在各种各种损伤因素的作用下，肺泡上皮细胞发生EMT 并使标志性蛋白ɑ-SMA 表达上调，上皮细胞标志物E-cad 逐渐丢失，细胞外基质大量生成和沉积，导致肺间质纤维化发生［13］。此外，TGF-β1／Smad 信号通路被激活，TGF-β1 信号下传首先接触Smad 蛋白，建立起细胞质及细胞核间的信号传导通路，进而使TGF-β 下游效应因子CTGF、MMP-2、VEGF 表达上调加重纤维化程度［14］。CollagenⅠ、CollagenⅢ作为细胞外基质（ECM）主要成分，是由Fb 及其转型后的MFb 合成和分泌，ɑ-SMA 是Fb 转型为MFb 的标志，肺纤维化疾病产生时，TGF-β1／Smads 信号通路被激活，ɑ-SMA 表达上调，间接使CollagenⅠ、CollagenⅢ合成增多，增加ECM，加重纤维化程度［15］。HYP 主要存在于胶原蛋白内，随着胶原蛋白生成的增多而增高，故可作为反映胶原水平的间接指标，常被用于评价肺纤维化［16］。TNF-α 可促进肺胶原纤维的过度增生，并增加细胞外基质的分泌，造成肺纤维化的病理改变［17］。

本研究采用气管注入博来霉素（BLM，10 mg／kg）建立肺纤维化大鼠模型，通过Smad3 基因沉默及运用Smad蛋白抑制剂进行干预，观察虎杖总蒽醌对肺间质纤维化大鼠上皮间质转化过程中TGFβ1-smad 信号通路的影响［18］。研究发现，虎杖总蒽醌可升高大鼠肺组织中E-cad 水平，降低TGF-β、Smad3、ɑ-SMA、CTGF 水平，而SiRNA+虎杖总蒽醌组及Smad3 抑制剂+虎杖总蒽醌组大鼠肺组织中Ecad 水平降低，TGF-β、Smad3、ɑ-SMA、CTGF 水平升高，与虎杖总蒽醌组形成相反趋势；肺组织及血清指标检测可知，虎杖总蒽醌组肺组织HYP、血清CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNF-ɑ、VEGF、MMP-2 水平均有所降低，SiRNA+虎杖总蒽醌组与Smad3 抑制剂+虎杖总蒽醌组大鼠肺组织HYP、血清CollagenⅠ、CollagenⅢ、血清TNF-ɑ、VEGF、MMP-2水平呈现升高趋势，与虎杖总蒽醌组形成相反趋势。

此次研究可知，虎杖总蒽醌可能通过阻断Smad3-TGFβ1 信号传导通路，减少TGF-β 的表达，阻断该信号通路减少TGF-β 下游效应因子表达，并降低肺组织HYP 及血清TNF-ɑ 炎症因子作用，进一步抑制上皮细胞向成纤维细胞转化，从而延缓肺纤维化的进展。此外，本研究选取中药虎杖为研究对象，利用中医药靶点丰富、副作用少、适用于临床的显著优势，为临床攻克肺间质纤维化疾病提供了一定的实验支撑及用药指导。但本研究仅选取TGFβ1-smad信号通路进行研究，与肺间质纤维化相关的其他通路如PI3K-AKT-mTOR 信号通路、Wnt 信号通路、MAPK 信号通路及NF-κB 信号通路等方面并未进行相关研究，此外，本次研究数据方面稍显不足，后续将进一步扩大研究范围，对中药虎杖在肺间质纤维化方面进行更加深入研究，为临床攻克肺间质纤维化疾病提供一定实验支撑及用药指导。