连梅颗粒对2 型糖尿病GK 大鼠的降糖作用

吴光超 杨 涛 郑绍琴苏颖杭付 琳王 琪邓长生徐志勇张红英宋健平∗

（1.广州中医药大学科技园产业园，广东广州 510445；2.广州中医药大学，广东广州 510006）

糖尿病是一种代谢性疾病，其特征为血糖水平升高，以2 型糖尿病为主要类型，其引起的并发症是糖尿病患者主要死因［1］，2016 年全球患者达到4.22 亿，而在我国就有1.1 亿［2］。2 型糖尿病发病机制复杂，胰岛素抵抗是其主要因素之一，故改善胰岛素抵抗的药物研究备受关注。

Goto-Kakizaki（GK）大鼠为自发型2 型糖尿病模型，是由多基因缺陷和环境因素相互作用导致，是国际公认较为理想模型［3-4］。连梅颗粒是国医大师伍炳彩教授治疗2 型糖尿病的经验方，组方思路来源于《温病条辨》 中的连梅汤，由乌梅、麦冬、生地、黄连、山药、玄参、黄芪、苍术组成，对气阴不足、虚火上炎型2 型糖尿病有明显功效。本实验研究连梅颗粒对2 型糖尿病模型GK 大鼠的影响，并探讨其作用机制，以期为中医药相关治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级自发性2 型糖尿病GK 大鼠，雄性，体质量130～150 g，5～8 周龄，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司，单位生产许可证号SCXK（沪）2012- 0002；SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量130～150 g，5～8 周龄，购自广州中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（粤）2013-0034，均饲养于广州中医药大学科技产业园动物实验中心，每笼4 只。

1.2 药材 连梅颗粒浸膏（广东新南方青蒿药业有限公司，批号130916，1 kg／袋，每1 g 相当于2.605 g 生药），以君药黄连中小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀含量为评价指标，确定最优水煎煮工艺为8 味中药加10 倍水量煎煮3 次，每次1 h，滤液在80 ℃下浓缩成相对密度为1.25～1.30［5］。

1.3 试剂与药物 格列齐特片（广东华南药业集团有限公司，批号 131101；葡萄糖（天津福晨化学试剂厂，批号20120602。大鼠胰岛素检测试剂盒（天津博瑞康生物科技有限公司，批号BRK-E80-8174061104）；大鼠糖化血红蛋白检测试剂盒（上海丽臣生物科技有限公司，批号05／2015）；超氧化物歧化酶（批号20150615）、丙二醛（批号20150613 试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.4 仪器 电子天平（十万分之一，型号JJ2000，常熟市双杰测试仪器厂）；恒温水浴箱（型号HH-6，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司）；罗氏血糖仪及试纸（德国罗氏诊断有限公司）；酶标仪（型号ELX800UV，美国Bio-Tek公司）；组织脱水机（型号TP1020）、石蜡包埋机（型号EG1160）、光学正立显微镜（型号DMLB）、轮转切片机（型号RM2135）（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 造模 80 只GK 大鼠适应性饲养后，每隔3 周检测空腹血糖。12 周后，大鼠灌胃给予10 mL／kg 高脂乳剂，每天1 次，连续2 周，以诱导其自发性血糖升高。结果，有40 只FBG≥11.1 mmol／L，即符合2 型糖尿病模型，纳入实验［6］。

2.2 分组与给药 将“2.1”项下符合成模标准的40 只GK 大鼠按随机数字表法分为5 组，分别为模型组、格列齐特片组及连梅颗粒高、中、低剂量组，另取SD 大鼠作为正常对照组，每组8 只。模型组、正常组大鼠给予基础饲料喂养及等量纯净水灌胃，格列齐特片组灌胃给药剂量为16.67 mg／kg，连梅颗粒高、中、低剂量组灌胃给药剂量分别为10.52、5.26、2.63 g／kg，每天1 次，连续9 周。

2.3 指标检测 ①给药0、3、6、9 周，大鼠禁食不禁水12 h 后刀片划割尾静脉采微血，检测空腹血糖水平；②给药9 周，大鼠禁食不禁水12 h 后，取微血进行糖耐量试验（OGTT），计算曲线下面积（AUC）；③OGTT 测定完毕后，大鼠主动脉取血，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清胰岛素（INS）水平，根据FBG、INS 水平计算胰岛素抵抗指数（IRI）、胰岛素敏感指数（ISI），公式分别为IRI ＝（FBG×INS）／22.5、ISI＝1／（FBG×INS）；④ELISA 检测血清糖化血红蛋白水平；⑤化学比色法检测血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平；⑥采全血后快速剖取胰腺，固定于10%中性福尔马林溶液中，常规石蜡包埋，HE 染色，正置显微成像系统观察胰岛细胞组织形态、体积、排列等情况。

2.4 统计学分析 通过SPSS 25.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般症状 正常组大鼠体形、饮食、大小便均正常，较为活跃，毛色光泽；模型组大鼠体形较瘦，反应迟钝，毛色枯槁，有脱毛现象，明显出现多饮多尿症状；与模型组比较，给药组大鼠多饮多尿症状明显改善。

3.2 连梅颗粒对大鼠空腹血糖的影响 给药前，与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠空腹血糖无明显变化（P＞0.05）。给药6周后，与模型组比较，各给药组（除连梅颗粒低剂量组）大鼠空腹血糖降低（P＜0.05，P＜0.01）。给药9 周后，与模型组比较，各给药组大鼠空腹血糖降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 连梅颗粒对大鼠空腹血糖的影响（， n＝8）

表1 连梅颗粒对大鼠空腹血糖的影响（， n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0. 05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.3 连梅颗粒对大鼠糖化血红蛋白水平的影响 给药9 周后，与正常组比较，模型组大鼠糖化血红蛋白水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，连梅颗粒低、高剂量组大鼠糖化血红蛋白水平降低（P＜0.05，P＜0.01），以高剂量组更明显。见表2。

3.4 OGTT 试验 给药9 周后，与模型组比较，各给药组对糖耐量减损的血糖升高有抑制作用（P＜0.05），以连梅颗粒中剂量组、格列齐特片组更明显（P＜0.01）；格列齐特片组曲线下面积最小（P＜0.01）。见表3。

表2 连梅颗粒对大鼠糖化血红蛋白水平的影响（，n＝8）

表2 连梅颗粒对大鼠糖化血红蛋白水平的影响（，n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0. 05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

表3 各组OGTT 试验结果（， n＝8）

表3 各组OGTT 试验结果（， n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0. 05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.5 连梅颗粒对大鼠血清INS 水平及IRI、ISI 的影响 正常组大鼠血清INS 水平高于其他组（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清INS 水平无明显变化（P＞0.05），但连梅颗粒高剂量组、格列齐特片组IRI 降低（P＜0.05，P＜0.01），ISI 升高（P＜0.05）。见表4。

表4 连梅颗粒对大鼠血清INS 水平及IRI、ISI 的影响（， n＝8）

表4 连梅颗粒对大鼠血清INS 水平及IRI、ISI 的影响（， n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0. 05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.6 连梅颗粒对大鼠血清SOD 活性及MDA 水平的影响与正常组比较，模型组大鼠血清SOD 活性降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清SOD 活性升高（P＜0.01）。与正常组比较，模型组MDA 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，连梅颗粒中、高剂量组及格列齐特片组大鼠血清MDA 水平降低（P＜0.01）。见表5。

表5 连梅颗粒对大鼠血清SOD 活性及MDA 水平的影响（， n＝8）

表5 连梅颗粒对大鼠血清SOD 活性及MDA 水平的影响（， n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0. 05；与模型组比较，##P＜0.01.

3.7 大鼠胰腺病理组织学 与正常组比较，模型组大鼠胰岛细胞形态不规则，与周围组织界限不清晰，胰岛内出现胰岛细胞核密集现象，但未见明显空泡性和细胞坏死现象（图1A～1B）；与模型组比较，连梅颗粒各剂量组大鼠胰岛形态基本规则，边界稍清晰，未见细胞核密集现象，胰岛细胞排列较整齐，可见散在的胰岛细胞呈团状增殖，而且高剂量组胰岛体积形态较规则，胰岛细胞数目最多（图1C～1E）；格列齐特片组大鼠胰岛形态明显好转，但胰岛细胞数目较少（图1F）。

图1 各组大鼠胰岛组织病理变化（HE，×100）

4 讨论

2 型糖尿病是由胰岛素分泌缺陷、胰岛素抵抗引起血糖升高的代谢性疾病，其发生大多与遗传、环境因素相关［7］。GK 大鼠属于自发型的2 型糖尿病模型，其发病机制与人类相似，是Goto 等［8］用Wistar 大鼠近交数代重复繁殖而来。连梅颗粒是以连梅汤为基础化裁而来，后者出自《温病条辨》 暑温伏暑第36 条，云“暑邪深入少阴消渴者，连梅汤主之”，而消渴正是2 型糖尿病主要症状之一，原方中乌梅合黄连酸苦泄热，乌梅合麦冬、生地、阿胶酸甘化阴，用于治疗上有心火亢盛、下有肝肾阴亏之证，伍炳彩教授匠心独运，在其基础上去阿胶之温热，加玄参之凉润，合黄芪益气健脾、山药滋养脾阴、苍术运脾化津，全方共奏滋肾泄热、益气健脾生津之功效。

持续高血糖是糖尿病发病主要特点，临床上常以糖化血红蛋白来反映患者近期血糖控制水平。本实验发现，不同剂量连梅颗粒均能够明显降低大鼠空腹血糖，以高剂量组降低HbAlc 水平程度最大，并存在一定剂量依赖性。

国内外研究表明，胰岛β 细胞功能损伤是导致糖耐量受损转变为糖尿病的根本因素，故控制血糖升高、促进胰岛β 细胞增殖分化是治疗糖尿病的关键［9-10］。本实验发现，模型组大鼠葡萄糖耐受能力、胰岛素水平、胰岛抵抗、敏感指数明显降低，符合2 型糖尿病发病特点；给药9 周后，与模型组比较，各给药组大鼠INS 无明显变化，但OGTT实验结果显示各给药组能明显抑制血糖升高，其中连梅颗粒高剂量组、格列齐特片组还可明显降低胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感。格列齐特片是临床常用口服降糖药，为WHO 推荐的胰岛素促泌剂［11］，而高剂量连梅颗粒也能促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，增加胰岛素敏感。

胰岛素是唯一有效的降糖激素，仅由胰岛β 细胞合成分泌，文献［12-13］报道β 细胞具有一定自我修复能力，但长期高血糖状态引发氧化应激功能失调会诱发其凋亡。血清SOD 是一种能消除体内自由基的抗氧化酶，可有效消除活性氧、活性氮，从而减少细胞损伤；MDA 为脂质过氧化物的终产物，是反映体内脂质氧化损伤的敏感指标，本实验发现，与正常组比较，模型组大鼠SOD 活性明显降低，MDA 水平明显升高，进一步验证氧化应激反应参与2 型糖尿病形成。高血糖可刺激机体产生更多的自由基，从而诱发多价不饱和脂肪酸生成过氧化脂质，导致胰岛β 细胞生物膜变性死亡［14］，而连梅颗粒能提高GK 大鼠血清SOD 活性，降低MDA 水平，从而减轻因氧化应激反应导致胰岛细胞损伤。HE 染色发现，不同剂量连梅颗粒均能抑制胰岛细胞凋亡，促进胰岛细胞增殖分化，对其有一定保护和修复功能。

综上所述，连梅颗粒可降低2 型糖尿病GK 大鼠空腹血糖、HbA1c 水平，改善糖耐量减损后血糖升高，并呈一定剂量依赖性，其作用机制可能是通过抗氧化机制来保护胰岛细胞功能，同时改善胰岛抵抗，促进胰岛素释放，但具体分子机制仍需作进一步研究。