不同干燥方式对川芎多糖理化性质及抗氧化活性的影响

陈 欢，姜媛媛∗，徐 峰，张 利，胡 佳，吴金勇，王海平

（1.四川农业大学理学院，四川雅安 625014；2.四川省食品药品检验检测院，四川成都 611731）

川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎，具有祛风止痛、活血祛瘀的功效［1］，富含多糖、生物碱、挥发油、内酯等多种化学成分，广泛应用于心血管疾病的预防与治疗［2］。多糖作为川芎主要活性成分之一，主要由木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖组成［3］，具有抗菌、抗氧化、抑制肝癌细胞HepG2 增殖［4］等活性，目前已成为研究热点，具有开发利用的潜力。

多酚、黄酮、花青素、多糖［5］等天然活性成分在清除自由基、防止生物体内过氧化中发挥重要作用，可作为潜在的新型天然抗氧化剂。多糖生物活性与其分子结构、水溶性、分子量、黏度等性质密切相关［6］，主要受样品处理方法、提取工艺、干燥方式等因素的影响［7］，其特征结构的破坏可能会导致其生物活性显著下降。目前，多糖制备过程中常用的干燥方式有冷冻干燥、真空干燥、热风干燥，其中热风干燥在食品工业中应用最广泛，成本也最低廉，但在高温有氧条件下会破坏多糖品质和活性；真空干燥在除去水分的同时可防止多糖与氧气结合而发生氧化，但生产效率低；冷冻干燥通过升华除去物质中水分，在低温缺氧条件下可抑制微生物生长、酶反应，从而生产出高品质多糖。目前，对川芎多糖的研究主要集中在提取、分离、纯化、活性等方面，但尚无干燥方式对该成分理化性质、抗氧化活性影响的报道。

因此，本实验比较热风干燥、真空干燥、冷冻干燥所得川芎多糖在理化性质、抗氧化活性方面的差异，进而探讨不同干燥方式对该成分理化性质、抗氧化活性的影响，为其进一步开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 药材 川芎采自四川绵竹川芎高效种植示范基地，经四川农业大学生命科学学院杨瑞武教授鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.，洗净后50 ℃下烘干，粉碎，过60 目筛，干燥保存。

1.2 试剂与药物 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、四唑氮蓝（NBT）、还原型辅酶I 钠盐（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）均为分析纯，购于美国Sigma-Aldrich 公司。葡萄糖、苯酚、无水乙醇均为分析纯，浓硫酸为优级纯，购于成都市科龙化工试剂有限公司。

1.3 仪器 CP-114 电子天平，购于上海洪纪仪器设备有限公司；SB-600DTD 超声波清洗机，购于宁波新芝生物科技股份有限公司；透析袋（截留分子量8 000 Da），购于成都市科龙化工试剂有限公司；LGJ-12 冷冻干燥机，购于北京松源华兴科技发展有限公司；GL-22MS 高速冷冻离心机，购于匡贝实业有限公司；DZ-2BC 真空干燥箱，购于天津泰斯特仪器有限公司；DGZ-9240 电热恒温鼓风干燥箱，购于上海一恒科技有限公司；FTIR-8400S 红外光谱仪，购于日本Shimadzu 公司。

2 方法

2.1 川芎多糖制备 采用超声波联合热水浸提法提取多糖。准确称取50 g 药材粉末，置于圆底烧瓶中，以1∶16料液比加水，超声（40 kHz、200 W）处理17 min，置于60 ℃恒温水浴中提取4.3 h，提取液真空浓缩后Sevage 法脱蛋白，蒸馏水透析48 h，透析液真空浓缩至原体积的1／10，4 倍量乙醇沉淀，离心后收集沉淀，分别采用热风干燥（60 ℃）、真空干燥（60 ℃，0.06 MPa）、冷冻干燥（-40 ℃，100 Pa）干燥至含水量小于10%［8］，即得，计算得率，公式为得率＝粗多糖质量／药材粉末质量×100%。

2.2 含水量测定 准确称取热风、真空、冷冻干燥所得多糖各1 g 至称量瓶中，置于120 ℃恒温干燥箱中干燥2 h。移入干燥器内冷却至室温，反复称定质量至恒重，计算含水量，公式为含水量＝ ［（M1-M2）／（M1-M0）］×100%。其中，M0为称量瓶质量（g），M1为干燥前多糖、称量瓶总质量（g），M2为干燥后多糖、称量瓶总质量（g）。

2.3 总糖、糖醛酸、蛋白质含量测定

2.3.1 总糖 采用苯酚-硫酸法［9］。以葡萄糖质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝5.535X+0.202 5（R2＝0.998 0），在0.005～0.05 mg／mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.2 糖醛酸 采用硫酸-咔唑法［10］。以半乳糖醛酸质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝3.405X-0.061 3（R2＝0.999 0），在0.02～0.1 mg／mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 蛋白质 采用考马斯亮蓝G-250 法［11］。以蛋白质质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝5.165X-0.025 3（R2＝0.999 0），在0.02～0.1 mg／mL范围内呈良好的线性关系。

2.4 淀粉、酚羟基鉴定 采用I2-KI 试验鉴定淀粉，FeCl3显色反应鉴定酚羟基。

2.5 红外光谱分析 准确称取热风、真空、冷冻干燥所得多糖各2 mg，加入100 mg KBr 充分研磨，压片，置于FTIR中，在4 000～450 cm-1波数范围内扫描，观察谱峰［12］。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH 自由基清除能力 参照Hu 等［13］报道的方法。准确称取热风、真空、冷冻干燥所得多糖各0.3 g，制成0～3.0 mg／mL 样品溶液，与2 mL DPPH 乙醇溶液（0.2 mmol／L）混合，室温下暗处反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度，重复3 次，取平均值，计算清除率，公式为清除率＝ ［（A对照-A样品）／A对照］×100%。其中，A对照为蒸馏水替代样品溶液的吸光度，A样品为样品溶液或维生素C 溶液的吸光度。

2.6.2 羟基自由基清除能力 参照Hao 等［14］报道的方法。准确称取热风、真空、冷冻干燥所得多糖各0.4 g，制成0～4.0 mg／mL 样品溶液，依次加入1.5 mmol／L 邻二氮菲溶液1.0 mL、0.2 mol／L 磷酸盐缓冲溶液（pH ＝7.4）2.0 mL、1.5 mmol／L 硫酸亚铁溶液1.0 mL、样品溶液1.0 mL、0.01% H2O2溶液1.0 mL，在37 ℃恒温下水浴1 h，于536 nm 波长处测定吸光度，重复3 次，取平均值，计算清除率，公式为清除率＝ ［（A样品-A空白）／（A对照-A空白）］×100%。其中，A对照为蒸馏水替代样品溶液的吸光度，A样品为样品溶液或维生素C 溶液的吸光度，A空白为不加双氧水的混合反应溶液的吸光度。

2.6.3 超氧阴离子清除能力 参照Xu 等［15］报道的方法，采用氮蓝四唑（NBT）法测定。准确称取热风、真空、冷冻干燥所得多糖各0.3 g，制成0～3.0 mg／mL 样品溶液，加入样品溶液1.5 mL、300 μmol／L NBT 溶液0.50 mL、468 μmol／L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型辅酶Ⅰ（NADH）溶液0.50 mL、60 μmol／L 过硫酸氢钾（PMS）溶液0.50 mL，在25 ℃下恒温5 min，于700 nm 波长处测定吸光度，0.15 mol／L PBS 溶液（pH ＝7.6）代替样品溶液作为空白对照，重复3 次，取平均值，计算清除率，公式为清除率＝ ［（A对照-A样品）／A对照］×100%。其中，A样品为样品溶液或维生素C 溶液的吸光度，A对照为PBS 溶液的吸光度。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同干燥方式对川芎多糖理化性质的影响

3.1.1 外观色泽、成分组成 表1 显示，热风、真空、冷冻干燥所得多糖均为淡黄色固体，无臭无味，KI、FeCI3反应均呈阴性，表明均为不含酚类的非淀粉类多糖；冷冻干燥下多糖得率显著高于真空、热风干燥下（P＜0.05），并且总糖含量最高，而热风干燥下总糖含量最低；多糖均含有一定量糖醛酸、蛋白质，表明均含有少量蛋白质的酸性成分；真空干燥下多糖糖醛酸含量最高，冷冻干燥下最低，热风、冷冻干燥下无明显差异（P＞0.05）；冷冻干燥下蛋白质含量高于热风、真空干燥下（P＜0.05）。

表1 不同干燥方式对川芎多糖理化性质的影响（）

表1 不同干燥方式对川芎多糖理化性质的影响（）

注：同一列不同小写字母表示差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.1.2 红外光谱 图1 显示，热风、真空、冷冻干燥所得多糖都有明显特征吸收，其中3 353 cm-1附近的宽峰是由O-H 伸缩振动吸收产生，表明存在分子间氢键；2 925 cm-1附近为C-H 伸缩振动吸收峰［16］；在1 735 cm-1处的吸收为羰基-C＝O 的伸缩振动吸收峰；在1 640 cm-1处的吸收峰是由-OH 的弯曲振动产生；1 410 cm-1附近为-CH2的变形吸收峰；1 024 cm-1附近的吸收峰是由吡喃糖环醚键（C-O-C）、醇羟基的变角振动产生［17］；930 cm-1附近的吸收峰为吡喃环振动的特征吸收；在870 cm-1处为β-糖苷键的吸收峰，表明川芎多糖由β-吡喃糖苷键连接。

图1 川芎多糖红外光谱图

3.2 不同干燥方式对川芎多糖抗氧化活性的影响

3.2.1 DPPH 自由基清除能力 图2 显示，热风、真空、冷冻干燥所得多糖对DPPH 自由基的清除率均随其质量浓度（0～3.0 mg／mL）增加而逐渐升高，分别达到76.32%、80.74%、85.29%；当多糖质量浓度小于2.0 mg／mL 时，其清除率上升较快，而在2.0～3.0 mg／mL 时上升程度较平缓；3 种干燥方式下IC50分别为1.71、1.58、1.37 mg／mL，表明冷冻干燥多糖清除DPPH 自由基的能力强于热风、真空干燥。

3.2.2 羟基自由基清除能力 图3 显示，热风、真空、冷冻干燥所得多糖对羟基自由基的清除率均随其质量浓度增加而升高，IC50分别为3.01、2.91、2.74 mg／mL；当多糖质量浓度为4.0 mg／mL 时，3 种干燥方式下清除率分别达64.81%、67.23%、71.48%，表明冷冻干燥多糖对羟基自由基的清除能力最强。

图2 川芎多糖对DPPH 自由基的清除率

图3 川芎多糖对羟基自由基的清除率

3.2.3 超氧阴离子清除能力 图4 显示，热风、真空、冷冻干燥所得多糖对超氧阴离子的清除率均随其质量浓度（0～3.0 mg／mL）增加而升高，清除率分别达55.65%、52.72%、58.89%；当多糖质量浓度小于2.0 mg／mL 时，清除率上升较快，而在2.0～3.0 mg／mL 时上升程度较平缓；3种干燥方式下IC50值分别为3.15、3.38、2.71 mg／mL，表明冷冻干燥多糖对超氧阴离子的清除能力最强。

4 讨论与结论

多糖是具有多种生物活性的天然高分子化合物，其抗氧化活性、理化性质与空间构象有关［18］，而干燥方式作为该成分制备过程中的一个重要环节，可通过影响其理化性质而进一步影响其生物活性［19］。本实验发现，冷冻干燥、真空干燥、热风干燥所得川芎多糖在外观色泽、气味方面无差异，均不含淀粉、酚类；冷冻干燥下总糖含量最高，热风干燥下最低；真空干燥下糖醛酸含量最高，其他2 种方法下无明显差异；冷冻干燥下蛋白质含量最高，明显高于真空、热风干燥下。段梦颖等［20］发现，干燥方式对聚合草多糖理化性质有显著影响，其中冷冻干燥总糖含量最高。

图4 川芎多糖对超氧阴离子的清除率

研究表明，多糖中的-OH、-COOH、-C ＝O 等官能团均与其抗氧化活性有关［24］。本实验发现，冷冻干燥下总糖含量显著高于真空、热风干燥下，其较高的抗氧化活性可能与含有更多-OH、-C＝O 官能团有关。另外，多糖对自由基清除能力的强弱还与其所含蛋白质含量有关，其中的氨基酸可与羟基自由基相互作用，形成稳定的大分子自由基，从而达到清除自由基的效果［25］。但高温等外界条件会导致糖结合蛋白变性，可能会引起多糖构象受损，进而使其清除自由基活性降低［19］，由于真空、热风干燥所需温度较高，可能会导致多糖中结合蛋白变性，从而降低其抗氧化活性。喻俊等［22］发现，与热风、真空干燥比较，冷冻干燥下牛蒡多糖中蛋白质含量最高，抗氧化活性最强；Yang等［26］报道，超声波辅助亚临界水提取枸杞多糖中较高的蛋白质含量可能增强其抗氧化活性。另外，多糖结构上连接的糖醛酸可与蛋白质等其他成分结合起来，从而呈现各种活性［18］。本实验发现，冷冻干燥下抗氧化活性较强，可能与其含有较高总糖、蛋白质含量有关，同时糖醛酸会与部分蛋白质结合，进一步增强该活性。但也有研究指出，多糖抗氧化活性还与其分子量、三螺旋结构有关［27］，故川芎多糖抗氧化活性的机制还有待进一步研究。

热风、真空、冷冻干燥所得川芎多糖均为无臭无味的淡黄色固体，是不含多酚类的非淀粉类多糖。其中，冷冻干燥下总糖、蛋白质含量最高，分别为（87.72±1.45）%、（1.59±0.17）%；真空干燥下糖醛酸含量最高，为（2.66±0.09）%；3 种干燥方式下川芎多糖均具有较强的体外抗氧化活性，由高到低依次为冷冻干燥、真空干燥、热风干燥。

综上所述，川芎多糖具较强的抗氧化活性，今后可加强该成分在畜牧饲料中的应用研究。同时，冷冻干燥可作为制备优质功能性川芎多糖较好的干燥方式。