中药干预慢传输型便秘肠道水通道蛋白表达及其作用机制的研究进展

张丽娅，李 刚，王永兵∗

（1.上海中医药大学研究生院，上海 201203；2.上海健康医学院附属浦东新区人民医院，上海 201200）

参照罗马Ⅲ的定义标准，功能性便秘是非器质性原因引起、排除肠易激综合征的慢性便秘，在临床最常见，按结肠动力学特点分为慢传输型便秘、功能性出口梗阻型便秘和混合型便秘，西方人群患病率在2%～28%［1-2］，我国普通人群患病率为8.2%。其病因复杂，主要有（1）不良的饮食、生活习惯；（2）忽视便意或滥用泻剂造成直肠反射敏感性降低；（3）精神因素引起的肠壁交感神经兴奋抑制肠道蠕动。由于肠蠕动频率下降，粪便在肠道内存储时间长，水分被过多吸收，粪质表面凹凸干硬，甚至呈硬球状，往往需努挣而下，极大延长如厕时间。长期如此易患肛周直肠疾病，还会诱发心、脑血管疾病发作，增加猝死风险，而随着病程的迁延，便秘伴有焦虑、抑郁症的概率增大，给病患带来身体和精神的双重折磨。

上世纪90 年代，Agree 偶然在红细胞膜上分离出一种相对分子质量为28 kDa 的疏水性跨膜蛋白［3］，具有明确的水转运功能，坐实细胞膜上存在转运水的“水通道蛋白”理论猜想，基因组命名委员会于1997 年正式命名为“AQP1”。随后，在人类、动植物及微生物体内相继发现了一系列类似的专一介导水转运的蛋白质，统称为水通道蛋白（AQPs）。随着对AQPs 结构与功能的深入研究，发现其分布广泛，蛋白表达量改变参与多个系统疾病的发生发展，而结肠中的AQPs 表达变化与便秘密切相关，有望成为治疗便秘的新靶点。而随着中医药在临床探索的不断深入，传统中药治疗便秘的独特优势日益受到重视。本文综述近年来有关AQPs 在慢传输型便秘（STC）肠道中的表达改变，中药干预引起肠道AQPs 变化，以及体内调控AQPs的信号通路，希望为中药治疗STC 作用机制的研究和靶向药物的研发提供新的思路。

1 AQPs 基本情况

1.1 基本结构 人体内已鉴定出13 个AQPs 亚型，属主要内源性蛋白（MIP）家族，由250～295 个氨基酸组成［4］。所有亚型可能由同一基因组进化而来，结构相似，典型的AQPs 有四级结构组成，一级结构的冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸（NPA）高度保守位点构成通透水分子的基础结构，二级结构形成跨膜区域，在此基础上整合构成三级立体“沙漏”结构是AQPs 的跨膜通道，最后由功能独立的亚基包绕成四聚体的形式存在［5］。AQPs 对水分的快速转运功能取决自身通道核心部分的选择性过滤器［6］。

1.2 定位与功能 随着对AQPs 研究的深入，人们发现该蛋白各亚型的功能发挥与其所定位的组织细胞相关，定位于血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞上的AQP1，参与血管和淋巴管的生成，还与肿瘤关系最为密切［7-8］；位于肾脏集合管主细胞管腔侧（顶端）的细胞膜上和细胞质内的AQP2，参与调节尿液浓缩［9］；AQP3 定位于皮肤的角质形成细胞和树突状细胞表面，与皮肤保湿、固有免疫和获得性免疫有关［10］，而当AQP3 定位于肾小管上皮细胞，其表达异常变与多囊肾的发病相关［11］；AQP4 在脑中分布极广泛，涉及脑缺血、脑水肿等病理生理过程［12］；卵巢上皮源性肿瘤病变与该处AQP5 异常改变有关［13］；目前仅在肾脏中检测到AQP6 的表达［14］。主要表达在脂肪组织中的AQP7，同时介导体内水和甘油的转运［15］，上调肝脏中AQP7 表达降低肝脏甘油三酯积蓄，缓解脂肪肝［16］；调控AQP8 在人胎膜的表达介导羊水的跨膜转运，从而调节羊水量［17］。可以看出，AQPs 多分布在与体液吸收、分泌相关的上皮细胞和内皮细胞上，研究水通道蛋白的作用机制，具有重要的生理病理以及药物学意义［18］。既往认为肠道体液平衡依赖简单扩散，目前已证实在人和啮齿类动物的消化道有9 种AQPs 亚型表达，说明AQPs 介导的跨膜水转运在消化系统的液体平衡中占据重要位置［19-20］。

2 结肠AQPs 在STC 中的表达改变

STC 是最为常见的功能性便秘类型，表现为无便意、粪便干结引起的排便困难。机制尚不清楚，主要与肠神经系统、Cajal 间质细胞、肠道平滑肌、脑肠神经递质等的异常相关［21-22］。STC 的关键问题是肠道动力和水分代谢的异常导致粪便传输缓慢和粪含水量减少。定位于结肠的AQPs（AQP1、3、4、7、8、11）异常表达，与肠道水液过多吸收、肠液分泌减少的发生密切相关［19］。功能抑制剂HgCl2仅减弱AQP3 的功能而不影响结肠的分布和表达，但水液由肠腔侧向血管侧的转移减少，展示了AQPs 肠道水转运的能力［23］；检测STC 患者切除的结肠，右半结肠AQP3 增加，左半结肠AQP9 降低，表明升结肠AQP3 以水分吸收为主，降结肠AQP9 分泌肠液为主［24］；吗啡会引起严重便秘，患者结肠AQP3 表达显著增加，水液从肠腔进入血管侧，引起大便干结［25］。具体见表1［19，26］。

表1 AQPs 在结肠的分布

复制便秘动物模型同样检测到AQPs 的变化，地芬诺酯灌胃SD 大鼠，近端结肠AQP1、3、4 增高［27］；而该药干预昆明小鼠，升结肠AQP4 上升、降结肠AQP9 下降［28-29］；盐酸洛哌丁胺造模，SD 大鼠全肠AQP3 增高［30］。可能与造模方法以及亚型表达在种间存在差异有关。

3 中医对STC“水代谢失衡”的认识（便秘）

便秘最早见于《黄帝内经》，名为“大便难”“后不利”［31］，《素问·举痛论篇》曰：“热气留于小肠，肠中痛，瘅热焦渴，则坚干不得出，故痛而闭不通矣。”病位在大肠，病机是邪滞大肠，腑气闭塞不通或肠失濡润，致大肠传导功能失常，与脾胃肝肾等脏腑功能失调相关。

中医以“症”关联整体，重视症证结合。中医认为便秘日久必有津虚血少，肠燥失润表现，《丹溪心法·燥门》“今停蓄蕴结……则胃有燥粪，三焦伏热，则津液中干。”《诸病源候论》“大便不通者……热气偏入肠胃，津液竭燥……壅塞不通也”。另外，从关联的脏腑分析，脾主运化生后天阴液，脾升胃降，则肠道津液得充；肺主宣发肃降，与大肠相表里，若肺气不降，则津液不能下达，唐容川《血证论》“肺津不润则便结，肺气不降则便结，”详细概括了肺对大肠的影响；肝藏血、主疏泄，肝脏功能正常则气机升降有序、血液濡润肠道；肾藏精、主水液代谢，开窍于二阴，乃先天之本，肾阴不足，则肠失濡润。脾胃肝肾虚损影响体内津血生成和输布，故肠津不足、大便秘结难下，因此，便秘患者往往伴有口干、津亏之相，而虚损年老体弱者往往易患便秘。

便秘治疗首辨虚实，在此之上灵活运用滋阴、养血、润燥之法化解“肠道津液不足”。《丹溪心法》 曰“燥结血少，不能润泽，理宜养阴”，习作武教授在名家经验方基础上化裁增液麻子五仁汤，以滋阴增液、润肠通便之法治疗阴虚津亏肠燥便秘［32］。而通过调理脏腑虚损，也可以有效改善便秘，吴华堂教授善用麦冬麻仁汤治疗胃阴不足引起的肠燥便秘，效果满意［33］。

4 中医药对肠道AQPs 的作用

长期使用泻剂和促动力药效果不佳，易形成依赖性，还会造成胃肠道紊乱和神经系统的不良反应，中医认为“泻下之品”多寒凉，久用损伤人体正气，进一步减弱大肠传导之力。中药副作用小，疗效确切，运用现代生物技术加快其有效成分分析可为临床治疗提供更多的参考。

4.1 单味中药 大黄主要泻下活性成分为番泻苷A、大黄酸苷、蒽醌苷，在肠道代谢为游离蒽醌类发挥作用［34］。大黄总蒽醌（每天4 500、2 500 mg／kg）下调SD 便秘大鼠近端结肠AQP4 的表达量，表现为剂量一效应关系，肠道水分增加，粪便含水量提高，体外实验证实游离蒽醌大黄酸、大黄素（40、20 mg／L）作用于人源性结肠癌细胞LoVo后，AQP4 表达与体内一致，亦表现量效关系［35］。吴晓青等［36］将生、熟大黄按高、中、低剂量（5.00、2.50、1.00 g／kg）成组进行对比研究，生、熟大黄可抑制便秘KM 小鼠结肠AQP2、3、4 高表达，引起“泻下”表现，其生、熟等剂量组之间的干预效应存在明显差异（P＜0.05），亦反映了古人对大黄“生泻缓熟”评价。

近年临床大剂量应用生白术治疗便秘，白术主要成分白术内酯I（生理盐水配成10 mg／kg 的混悬液灌胃）可下调STC 小鼠结肠AQP3、4 表达，减少肠道水吸收，改善干硬粪质［37］。陈思敏等［38］煎煮白芍制成0.157 5、0.315 0、0.472 5 g／mL（含生药3.15、6.3、9.45 g／kg）的低、中、高3 种浓度，按等效剂量换算灌胃STC 大鼠2 周，结肠AQP3 表达增加，AQP4 表达下降，水分重吸收减少，中、高剂量效应存在统计学意义。

有研究将当归煎煮、过滤、浓缩（每1 mL水煎液相当于原生药1.7 g）后按16.67、8.33、4.17 g／kg 剂量（相当于临床60 kg 体质量成人日用量的20、10、5 倍）分别灌胃STC 小鼠（研究AQP8 表达实验中的煎液干预剂量分别是16.7、8.8、4.2 g／kg），当归煎液显著降低结肠AQP4、8蛋白，使水分留存肠腔内，高、中剂量效应明显［39-40］。

甘江华等［41］发现霍山石斛下调便秘大鼠近端结肠AQP3表达量产生泻下作用，干预剂量（0.7、1.4、2.8 g／kg）增加下调作用越明显；刘旭等［42］将决明子研磨后冲泡制成混悬液，以3.0 g／kg 等灌胃STC 小鼠后，有效下调肠道AQP3 表达，从而增加肠道水分，缓解便秘。《神农本草经》 中提到芍药“攻下”作用，现代药理研究发现白芍有效成分白芍总苷能促进肠道蠕动［43］。有文献报道白芍煎液灌胃STC 小鼠，结肠黏膜顶部吸收细胞的AQP4 表达量下降，肠道水分重吸收减少［44］。

4.2 中药复方 唐学贵教授在枳术丸基础上加味，自创便塞通合剂用于临床慢性便秘治疗，STC 大鼠按16 g／kg 药量干预1 周后，结肠AQP1、4、8 表达下调，水分重吸收减少，AQP9 表达上调后肠液分泌增加［45-46］。源于名医朱秉宜的通便汤，依据“津液论治”的立意，该组方制剂为每mL 含2.33 g 生药的成品，予以等效剂量18.65 g／（kg·d）的浓度干预STC 大鼠4 周，检测到结肠AQP3、4 表达受到抑制，通便颗粒在该方基础上经特殊工艺加工后，经换算按照3.28 g／（kg·d）灌胃复方苯乙哌啶造模的STC 大鼠，干预1 月后，免疫染色结果显示，肠道AQP3 表达显著下调，大鼠粪含水量增加［47-48］。分别将芪榔合剂加工制成每1 mL 含生药2.9 g 成品，予以大剂量0.05 mL／g、小剂量0.025 mL／g（相应量中药分别含生药 2.9 g／mL 和1.45 g／mL，相当于成人体质30 倍和15 倍）灌胃1 周，其“滋阴润燥，润肠通便”之效与下调结肠内AQP4、AQP8表达相符［49］。清代著名医家吴鞠通创增液汤，加味增液汤在此基础上加味化裁，换算等效剂量按照高、中、低剂量（每天33.2、16.6、8.30 g／kg）灌胃大鼠1 个月后，结肠AQP3、4 蛋白表达下调，组间量效关系不显著，其治疗津亏肠燥便秘之法“增水行舟”之功得以表现［50-51］。陈萌等［52］按0.1 mL／10 g 的给药体积（换算的每天等效高剂量96 g／kg、中剂量48 g／kg、低剂量24 g／kg）灌胃STC 大鼠化瘀通便汤，大鼠结肠AQP1、3 表达减少，肠道内粪便水含量增加。医家张元素改良《金匮》 枳术汤中君药白术、枳实的比例并制成丸剂，现代研究根据临床用药经验折算等效药量（含生药量，2 倍于临床用量18.0 g／kg，临床等效量9 g／kg）干预便秘小鼠，有效降低AQP4、8 mRNA 的表达，产生通便作用［53］。养阴润肠方熬煮浓缩成3 g／mL的水煎液，借鉴临床用药量换算成等效剂量（20.5 g／kg）连续干预15 d，便秘小鼠结肠AQP3 蛋白及mRNA 表达降低使肠道内水分吸收减少，AQP9 蛋白及mRNA 表达增加促进杯状细胞肠液分泌增加，促进排便［54］。另外，肖慧荣教授化裁麻元通便止痛汤，方中火麻仁、郁李仁润肠通便，大黄、白芍泻下行气，六味安消胶囊主要由大黄、木香、诃子等泻下、理气之品组成，两方各自在干预STC 大鼠的实验中存在肠道多个AQPs（AQP1、AQP3、AQP4 及AQP8）蛋白表达降低，粪便含水量增加［55-56］。

相对于单味药，复方在通便的基础上重视整体调理。随访增液润肠通腑汤和乳果糖干预肠燥津亏便秘患者，两者在改善大便干结、排便费力等主证方面的差异不大，但前者同时改善心烦失眠、潮热盗汗等阴亏症候，远期疗效评定优于乳果糖，且未有不良反应报告［57］。

5 中药调控AQPs 改变的信号通路

5.1 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路 MAPK 是介导信号有细胞外到细胞核内的重要途径，配体与细胞表面受体——酪氨酸激酶结合，按级顺序启动下游蛋白Ras、Raf 活化，经3 次级联磷酸化激活MAPK 转入细胞核内，调控基因层面的表达。通便汤通过抑制MAPKs 信号通路来下调大鼠结肠AQP3、4 的表达［58］。

5.2 环磷腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）信号通路血管活性肠肽（VIP）是一种广泛分布在神经系统和胃肠道的抑制性神经递质，影响肠道动力和肠道分泌。VIP 与特异性受体结合后，通过依赖性蛋白激酶连锁反应激活cAMP-PKA 信号途径，再诱导下游目标蛋白磷酸化发挥效应，AQPs 结构上含有PKA 磷酸化的同源结构域。硝菔通结方机制研究中，采用分离的大鼠结肠上皮细胞进行体外实验检测，经VIP 预先刺激的培养液中先后分别添加cAMP-PKA 通路抑制剂（H-89）、激动剂（8Br-cAMP），结果显示AQP3 表达水平与cAMP-PKA 通路的状态密切相关，抑制剂作用下的cAMP-PKA 通路，除cAMP、PKA 减少外，AQP3 蛋白及mRNA 表达显著减少，而随后添加激动剂作用后，cAMP、PKA 表达量逐渐恢复，AQP3 蛋白及mRNA表达亦显著增加，且呈现明显的时间依赖性［59］。

5.3 前列腺素E2（PGE2）细胞因子 PGE2具有调节细胞生长的功用，非甾体抗炎药（NSAIDs）抑制环氧化酶，减少PGE2合成。Kon 等［60］发现，大黄中的番泻苷A 经肠道代谢的生成物刺激巨噬细胞分泌PGE2，再经旁分泌降低大鼠结肠AQP3 表达；占煜等［61］给与便秘大鼠番泻苷A（50 mg／kg）灌胃5 h 后，经肠道代谢后生成大黄酸蒽酮（RA）下调AQP3 表达，抑制水分吸收，而添加NSAIDs，作用消失，表明PGE2参与调控AQPs 的表达。

5.4 蛋白激酶C（PKC）信号 在激素和神经递质的作用下，细胞膜受体与相应配体结合后激活磷酸脂酶C-β（PLC-β），该分子催化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）生成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），IP3 释放胞内Ca2+与DG 协同激活蛋白激酶C（PKC），PKC 进入质膜内调节细胞。便秘小鼠结肠PLC、IP3、AQP4 表达增高，经不同剂量当归煎液干预后，三者均下降，且存在量效关系，推测当归代谢物经PLC-IP3／DG-PKC 通路降低AQP4 表达［40］。

6 问题与展望

肠道AQPs 表达与分布的深入研究，对慢传输型便秘发病机制及治疗靶点的认识有了长足的进步。但个别研究提出相反的报道，例如，马黎倩报道［62］增液汤干预AQP3表达上调；通便颗粒调控STC 大鼠AQP8 表达有减少和增加的完全相反报道［47-48］，白术内酯I 下调STC 小鼠AQP［37］，而白术煎液上调STC 大鼠该蛋白AQP3［38］，猜测可能存在实验造模动物种族、品系之间的差异性，各亚型自身结构及其在肠道不同部位分泌细胞中分布比重；此外，肠内渗透压、pH、离子通道、体内其他因子和信号通路作用、AQPs 触发下层调控、基因层的调控有待进一步的发现和深入。另外，细胞膜的脂筏，其微区结构定位膜蛋白，有信号转导、维稳胞内Ca2+等功能，有报道称脂筏的脂质环境为AQPs 定位和发挥调控作用提供平台，Zheng 等［63］观测到ICR 小鼠表皮角质细胞的脂筏有共定位的AQP3，而冯丽鹏等［64］在Wistar 大鼠中未观测这一现象，推测可能与AQPs 亚型以及模型动物的品种相关。

近年来，中药治疗STC 的优势以及中医辩证整体思维越来越受到重视，符合现代生物医学模式。有些研究从便秘肠道关联脏腑着手，通便颗粒逆转STC 大鼠肺AQP1 和肠AQP3 表达升高［65］，彭圆等［66］发现津亏便秘小鼠皮肤AQP3、肺AQP1 表达增加，佐证藏象的“肺肠相表里”“肺合大肠，大肠者，皮其应”。梁星琛等［67］观测到便秘大鼠肾脏AQP2、3 和结肠的AQP3 上调，肾脏加速对水的吸收进而引发肠道水代谢紊乱引起便秘，反映中医“肾主水司二便”的思维。随着质谱分析、基因测序等技术从更精细的角度发掘中药的药效成分，相信基于“水通道学说”的中医药的便秘治疗会有新的突破，从而为相关临床治疗提供新的借鉴。