甘草黄酮提取分离方法的研究进展

申美伦，梁业飞，刘广欣，桑 杰，李翠芹

（陕西师范大学生命科学学院，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西西安 710062）

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草G.GlabraL.或胀果甘草G.inflataBat.的干燥根及根茎，具有补脾益气、祛痰止咳、清热解毒、调和诸药等功效［1］。现代药理研究表明，甘草黄酮具有抗炎、抗氧化［2］、抗病毒［3］等作用，目前已分离出300 多种［4］，主要活性成分有甘草苷、甘草素、异甘草素、光甘草定、甘草查尔酮A 等，其中光甘草定、甘草查尔酮A 分别为光果甘草胀果甘草中特有成分，广泛应用于药品、食品、化妆品等领域［5-6］，故生产高品质的该类化合物已成为生产企业急需解决的问题之一。

本文概述了甘草黄酮提取分离的方法，并针对上述操作过程中存在的资源浪费、耗能高、效率低、以单一类成分提取分离为目标等问题提出解决方法，以期为该类成分的相关后续研究提供参考。

1 甘草总黄酮

1.1 提取方法

1.1.1 溶剂提取法 溶剂提取法利用“相似相溶”原理对目标化合物进行提取，虽然存在提取时间长（90～210 min）、提取温度高（40～90 ℃）、溶剂用量大等缺点，但因其设备简单、操作简便，目前仍作为工业化生产甘草黄酮类化合物的主要方法。表1 显示，提取过甘草酸的甘草渣中总黄酮得率较高［7-8］，故可将其作为提取总黄酮的原料，避免资源浪费。另外，不同品种甘草中总黄酮含量有所不同［9］，故研究时应其甘草品种。

表1 溶剂提取法提取甘草总黄酮的工艺参数（）

表1 溶剂提取法提取甘草总黄酮的工艺参数（）

注：a 为提取率，b 为含量，c 为得率。

1.1.2 超声辅助提取法 超声辅助提取法根据空化作用在溶剂中局部形成高温高压，使样品内部疏松，增强溶剂穿透能力，提高有效成分提取率［12］，大多用乙醇作为提取溶剂。表2 显示，与传统溶剂提取法（40～90 ℃，90～210 min）相比，超声辅助提取法的温度较低（45～65 ℃），时间较短（25～120 min）。

1.1.3 微波辅助提取 微波辅助提取法通过微波使药材细胞承受高温高压瞬间破裂，细胞内有效成分溶于溶剂，从而提高目标成分提取率。表3 显示，与溶剂提取法（90～210 min）、超声提取法（25～120 min）相比，微波提取法（2.4～6 min）能大大缩短提取时间；β-环糊精作为提取溶剂时，可提高目标成分的水溶性与稳定性［16-17］，有利于提取甘草总黄酮。另外，微波提取法与其他方法联用也可用于甘草总黄酮的提取［18］。

表2 超声辅助提取法提取甘草总黄酮的工艺参数

表3 微波辅助提取法提取甘草总黄酮的工艺参数

1.1.4 其他方法 除上述提取方法外，还有双水相提取法、闪式提取法、超临界CO2萃取法、微生物混合发酵提取法等。其中，双水相提取法将不相混溶的两相亲水性提取体系作为溶剂，具有环保、低成本、集提取与分离为一体等优点［22］，与超声提取法结合后可提高两相提取体系的扩散速度和目标成分得率［23］；闪式提取法利用高速机械剪切力迅速将药材组织破碎，使溶剂更易进入药材内部提取目标成分，具有提取时间短、便于热敏性成分提取等优点，与常规溶剂提取法（60～210 min）相比其提取时间大大缩短（3 min），而目标成分得率无明显变化；超临界CO2萃取法选择超临界CO2作为提取溶剂，可使目标成分保持原有生物活性不变，无溶剂残留，而且提取过程绿色环保；微生物混合发酵提取法利用微生物完善植物细胞内木质纤维素降解酶系，促使纤维素酶酶解药材细胞壁［24］，提高目标成分提取率，而且其原料普遍为提取过甘草酸的甘草渣，可避免了资源浪费。具体见表4。

表4 其他方法提取甘草总黄酮的工艺参数

1.2 分离方法

1.2.1 聚酰胺柱色谱法 聚酰胺色谱利用分子中的酰胺羰基或酰胺键上的游离胺基与目标成分形成氢键而产生吸附，从而达到分离纯化目的。姜红红等［29］优化所得甘草总黄酮最佳纯化工艺条件为上样液pH 5，体积流量1 mL／min，径高比1∶10，上样质量浓度0.15 g／mL，纯度为90.12%。

1.2.2 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂利用范德华引力，根据吸附力和分子筛原理来达到分离、纯化、除杂等目的。表5 显示，用于分离纯化甘草总黄酮的大孔吸附树脂大多为非极性或中极性，其次上样液、洗脱液pH 由于会影响溶质电离程度而影响黄酮吸附率、解吸率［30-31］，故应对pH进行考察。

表5 大孔吸附树脂法分离甘草总黄酮的工艺参数

1.2.3 连续离子交换色谱法 连续离子交换色谱在离子交换色谱的基础上加以改进，将一个具有多个色谱柱的圆盘与多孔分配阀组合，利用分配阀的相对转换，使吸附、水洗、解析、再生等步骤在一个工艺流程系统中完成，具有溶剂用量小、分离时间短、回收率较高等优点。李清潭等［36］利用连续离子交换色谱法得到最佳分离工艺为上样液质量浓度1.0 mg／mL，体积2.70 L，体积流量12.5 mL／min，乙醇洗脱体积分数70%，体积1.80 L，体积流量12.50 mL／min；NaOH 洗脱浓度 0.50 mol／L，体积0.6 L，体积流量5.0 mL／min，甘草黄酮纯度为67.33%，得率2.68%。

1.2.4 反向二维色谱法 反向二维色谱法将不同分离机理的分离模式进行组合，以实现对复杂化学成分的分离和制备，具有高峰容量、高通量、高效率等优点。朱靖博等［37］利用反向二维色谱法构建甘草黄酮的系统分离手段，即以C18为分离及富集填料，甲醇-水、乙腈-水为流动相，水为富集稀释液，梯度洗脱、稀释富集液体积流量21 mL／min，上样量300 mg，富集次数3 次，可得到16 个甘草黄酮部位和甘草苷、甘草素等9 个化合物。

2 甘草苷、甘草素

甘草苷是甘草重要活性成分，属于二氢黄酮苷类化合物，具有抗抑郁［38］、心肌细胞保护作用［39］等药理活性，2015 年版《中国药典》 规定甘草及其浸膏中甘草苷含量应不低于0.5%［1］。甘草素属于二氢黄酮类化合物，是甘草苷苷元部分，具有抗炎［40-41］、保肝解毒［42-43］等作用。

2.1 提取方法

2.1.1 溶剂提取法 朱应怀等［44］利用氨水提取甘草苷，得到最佳提取条件为24 倍0.75% 氨水提取3 次，每次60 min，甘草苷平均提取率为72.3%；王振辉等［45］用正交试验优化加热回流提取甘草苷的最佳回流提取条件为10 倍量70%乙醇提取2 次，每次3 h，甘草苷得率为1.62%。

2.1.2 超声辅助提取法 丛景香［46］等得到超声辅助提取甘草苷的最佳条件为酸浓度0.5 mol／L，提取时间1.5 h，提取温度70 ℃，料液比1∶20，甘草苷质量分数6.850%。另外，与溶剂提取法（3～6 h）相比，超声辅助提取法（0.4～1.5 h）能缩短提取时间，减少溶剂用量。

2.1.3 酶水解法 任玲等［47］利用酶水解法得到甘草素最优提取工艺为纤维素酶添加量1.85%，酶解温度65 ℃，酶解时间131 min，甘草素转化率为98.6%。

2.2 分离方法 田彦芳等［48］用ADS-7 型大孔吸附树脂同时分离纯化包括甘草苷在内的6 种黄酮，避免了仅以甘草苷作为指标时造成的资源浪费。除常用的分离方法外［48-49］，还有多种新手段［50-55］的应用，其中超滤法［52］、固相萃取法［53-54］等在提取纯化甘草苷时能解决设备难以用于工业化、工艺繁琐等问题，适合大生产；络合萃取法通过被萃取物和萃取溶剂之间的化学反应，生成可溶于萃取溶剂的新萃合物，从而实现分离目的［55］，以其分离纯化甘草苷时不仅能减少溶剂用量，提高回收率，还具有简化分离工艺、无设备要求等优点，便于工业化推广。具体见表6。

表6 分离甘草苷、甘草素的工艺参数

3 光甘草定

光甘草定属于异黄酮类成分，是光果甘草中特有的黄酮类化合物，具有较强的酪氨酸酶抑制活性［56］。

3.1 提取方法

3.1.1 溶剂提取法 范玉涵等［57］报道，光甘草定最佳提取工艺为乙醇回流提取2 次，每次2 h，料液比1∶10，得率为0.156 6%。

3.1.2 超临界CO2萃取法 王宏鹏等［58］利用超临界CO2萃取光甘草定，发现最佳工艺条件为萃取温度45 ℃，萃取压力25 MPa，静态萃取时间60 min，得率为1.259%。

3.1.3 微波辅助提取法 李雪琴等［59］采用微波提取法提取光甘草定，发现最佳工艺为提取溶剂70%乙醇，料液比1∶15，提取温度65 ℃，提取时间40 min，粗提得率为1.259%，得率为0.009%。

3.2 分离方法 除常用分离方法外［57，60］，为解决工艺的工业化适用性问题，固相萃取法［61］、疏水性离子液体萃取法［62］、分子印迹法［63］等新技术因其显著减少溶剂用量、可重复使用、简化分离工艺、提高光甘草定回收率的优点而逐渐被开发应用。具体见表7。

表7 分离光甘草定的工艺参数

4 甘草查尔酮A

甘草查尔酮A 为查尔酮类成分，是胀果甘草中特有的黄酮类化合物，具有抑制酪氨酸酶活性［64］、抗菌消炎［65］等作用。目前，并无直接提取甘草查尔酮A 的方法，一般是先提取甘草总黄酮，再分离得到该成分，通常是几种方法联合应用。

Luo 等［35］将甘草粗提物经大孔树脂、聚酰胺层析后，甘草查尔酮A 纯度可达80.28%；韩龙哲等［66］将甘草总黄酮先经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（9∶1）为洗脱剂梯度洗脱，再经聚酰胺柱色谱分离，以甲醇-水（6∶4）为洗脱剂梯度洗脱，洗脱部分经重结晶后得甘草查尔酮A；鞠伟会等［67］将甘草总黄酮经大孔树脂、聚酰胺层析柱纯化后，再用乙醇重结晶，甘草查尔酮A 纯度可达95%以上。

5 结语与展望

目前，对甘草黄酮的提取已逐渐向低能耗、绿色环保、高提取率的方向发展，如超声辅助提取法［13-14，46］、双水相提取法［23］、超临界CO2萃取法［26，58］等，但如何将其规模从实验室小试扩大至中试车间，最终应用到实际生产仍需进行研究。同时，在上述操作过程中仍以甘草酸、甘草次酸等皂苷类成分开发利用为主，药渣中的黄酮有待进一步开发利用。另外，随着科学技术的发展，如何根据甘草中皂苷、黄酮、多糖本身的特点来研发节能环保高效的同时提取分离技术也应作为以后考察方向之一。

目前，甘草黄酮主要分离方法为大孔吸附树脂法［60，66，68-69］、聚酰胺柱色谱法［29，49］等，但目前大多以单一成分为目标，如何分离所有成分是今后研究的重点，同时寻找到适合其工业化的分离方法也是未来目标之一。近年来，模拟移动床色谱法［50］、离子液萃取法［51］、膜分离法［52］等新方法层出不穷，可不断探索它们在甘草黄酮分离中的应用，寻找到更环保高效、适用于工业化大生产的手段。