栀子枝7 种成分LC-MS 分析及HPLC-DAD 测定

缪芝硕，钟益玲，李海丽，吴 倩，邝 鼎，唐伟卓∗

（1.长沙学院生物与环境工程学院，湖南长沙 410022；2.湖南洋利农林科技有限责任公司，湖南岳阳 414400）

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果实，是一种常见的药食同源药材，广泛应用于特色茶饮和各种复方制剂中，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效［1-2］。传统医书记载，栀子除果实可入药外，其根部、枝、叶均可入药，用于热病心烦、湿热黄疸、淋证涩痛、血热吐衄、目赤肿痛等［3-4］。

栀子作为一种药食两用的资源，在我国产量十分丰富，主产于江西、湖北、湖南、浙江、广西等地，化学成分包括环烯醚萜、二萜、三萜、黄酮、有机酸、挥发油、多糖及各种微量元素等［5-7］。目前，对栀子的研究主要集中在传统用药部位果实上［8-11］，其他部位的成分报道较少。在采摘栀子果实的过程中，枝叶多被丢弃或焚烧，造成资源浪费和环境污染。有研究发现，栀子枝中含有一定环烯醚萜类、有机酸类等活性成分［12-13］，但有关其系统全面的定性分析，以及多指标成分的同时含量测定仍然比较缺乏。基于此，本研究采用HPLC-MS法对栀子枝化学成分进行定性分析，并建立HPLCDAD 法同时测定7 种成分的含量，以期为栀子不同部位的综合开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Ultimate 3000 超高效液相色谱仪、Q Exactive 轨道阱质谱（美国Thermo Fisher 公司）；Waters alliance e2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；KQ-400DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TMT-3 型电子天平（0.01 g，湖南湘仪天平仪器设备有限公司）；New-Classic MS 型电子天平（0.000 01 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；103B 型高速中药粉碎机（瑞安市永利制药机械有限公司）；101A-2B 型电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂股份有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

1.2 材料 栀子干燥枝条于2019 年7 月由湖南洋利农林科技有限责任公司提供，经长沙学院陈建荣教授鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis 的枝条，现保存于长沙学院生物与环境工程学院小分子天然产物研究实验室（ZZ001）。乙腈、甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。去乙酰基车叶草苷酸（批号MUST-19051720）、京尼平苷酸（批号MUST-19032203）、竹节参皂苷Ⅳa（批号MUST-19030201）、栀子苷（批号MUST-18103012）对照品（纯度≥98%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；京尼平龙胆双糖苷（批号P27S10F96112）、去甲基川陈皮素（批号W15A10Z95342）、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚（批号P30A10S87217）对照品（纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

2.1.1 HPLC-DAD 样品预处理 精密称取栀子枝条粉末（过40 目筛）1.0 g，置50 mL 锥形瓶中，加入25 mL 甲醇，精密称定质量，超声（400 W、40 kHz）提取45 min，放冷，甲醇补足减失的质量，上清液用0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 HPLC-MS 样品预处理 栀子枝粉碎，过40 目筛。取50 mg，加入800 μL 80%甲醇，涡旋30 s 混匀，4 ℃下超声提取30 min，-20 ℃下静置1 h，4 ℃、12 000 r／min 下离心15 min，取200 μL上清于进样小瓶中待检。

2.2 对照品溶液制备 精密称取去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、去甲基川陈皮素、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，按一定比例稀释制备成含上述对照品272.0、63.20、572.0、4.320、24.70、0.480 0、2.400 μg／mL 的溶液，即得。

2.3 分析条件

2.3.1 HPLC-DAD 色谱条件 YMC-Pack ODS-A柱（250 mm×10 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～18 min，5%～15%A；18～30 min，15%～33%A；30～40 min，33%～60% A；40～50 min，60%～95% A；50～51 min，95%～5% A；51～60 min，5% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；DAD 检测器采集范围200～800 nm；检测波长254、330 nm；进样量10 μL。

2.3.2 HPLC-MS 分析条件

2.3.2.1 HPLC Hyper gold C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相0.1% 甲酸水（A）-0.1% 甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～1.5 min，100%～80% A；1.5～9.5 min，80%～0A；9.5～14.5 min，0A；14.5～14.6 min，100% A；14.6～18 min，100%A）；体积流量0.35 mL／min；柱温40 ℃；自动进样器温度4 ℃；进样量10 μL。

2.3.2.2 MS 电喷雾离子源；正离子模式，加热器温度300 ℃；鞘气体积流量15 L／min；辅助气体积流量5 L／min；尾气体积流量0.33 L／min；电喷雾电压3.0 kV；毛细管温度350 ℃；一级全扫描（m／z70～1 050）；分辨率70 000；碰撞模式，高能量碰撞解离（HCD）。

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液1.0 mL，逐级稀释，制备成系列不同质量浓度的5 份溶液。精密吸取10 μL，在“2.3”项条件下进样，记录色谱图。分别以去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、去甲基川陈皮素、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.3”项条件下连续进样5 次，测得去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、去甲基川陈皮素、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚峰面积RSD 分别为2.37%、3.79%、3.60%、2.51%、2.61%、1.54%、1.43%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取同一批样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下于0、1、3、5、12、24 h 进样测定，测得去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、去甲基川陈皮素、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚峰面积RSD 分别为1.96%、3.80%、3.42%、3.79%、2.76%、1.51%、1.13%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批样品1.0 g，共5 份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样10 μL 测定，测得去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、去甲基川陈皮素、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚峰面积RSD 分别为2.07%、3.88%、3.72%、2.52%、2.61%、2.55%、2.97%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 称取同一批样品1.0 g，共9 份，每3 份加入含去乙酰基车叶草苷酸（68.00 μg／mL）、京尼平苷酸（15.80 μg／mL）、竹节参皂苷Ⅳa（143.0 μg／mL）、京尼平龙胆双糖苷（1.080 μg／mL）、栀子苷（6.170 μg／mL）、去甲基川陈皮素（0.119 0 μg／mL）、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚（0.600 0 μg／mL）的混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”项条件下进样，计算回收率。结果，去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、去甲基川陈皮素、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚平均加样回收率分别为101.90%、98.84%、99.56%、98.96%、100.67%、97.69%、100.44%，RSD 分别为2.18%、2.36%、3.03%、2.51%、2.34%、1.96%、2.46%。

2.6 HPLC-MS 定性分析 采用Compound discoverer软件对LC-MS 检测数据进行提取分析，通过高分辨质谱数据信息推导其可能的分子式，物质二级检测采用HCD 碰撞。通过主要碎片离子与标准质谱库对比、相关文献检索及对照品分析，从总离子流图中鉴定出30 个化合物，包括黄酮类7 个、萜类10 个、小分子芳香类6 个、有机酸2 个、其他类5 个。总离子流色谱图见图1，具体信息见表2。

图1 栀子枝各成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of various constituents in the stems of G.jasminoides

结果，鉴定了7 个黄酮类化合物，分别为峰10、11、12、13、14、17、18，主要结构类型为芦丁、山柰酚、槲皮素及其苷元的衍生物。一般来说，黄酮苷元的质谱裂解容易丢失CO，而黄酮苷类常存在糖片段及H2O 的中性丢失。峰12 在正离子模式下母核离子为m／z611 ［M+H］+，二级质谱中可见m／z303 ［M+H-C6H10O4-C6H10O5］+的碎片离子，质量丢失308，为脱去一分子芸香糖的特征信号，根据二级质谱碎片信息，与对照品对比，鉴定为芦丁；峰14 正离子模式下母核离子为m／z303［M+H］+，二级质谱中可见m／z285 ［M-H2O］+、275 ［M-CO］+、257 ［M-CO-H2O］+特征性碎片离子，以及由m／z257 经重排并丢失CO 的碎片离子m／z229，上述裂解规律与文献［14］一致，进一步通过对照品对比，鉴定为槲皮素；峰15 母核离子为m／z287 ［M+H］+，与峰14 相比分子量缺少m／z16，提示可能为少一个羟基的衍生物，同时二级质谱中观察到m／z241 及其丢失一个CO 的碎片离子m／z213，进一步通过对照品对比鉴定为山柰酚；峰13 也可以观察到m／z257、229 特征碎片离子，通过文献［15］及数据库对比鉴定为异鼠李素；峰17 可以观察到母离子m／z273 及特征碎片离子m／z119，经文献［16］对比和对照品分析鉴定为柚皮素；通过数据库对比分析，峰18 鉴定为香叶木素。另外，峰14 在一级质谱中可见m／z291 ［M+H］+母离子峰，二级质谱中观察到有m／z273 ［M+H-H2O］+、247 ［M+H-COO］+，以及环开裂产生的m／z206 ［M+H-COO-C3H5］+离子，低场还可见m／z165、147 碎片离子，结合文献［17］、数据库和对照品分析，鉴定为儿茶素。

表2 栀子枝各成分LC-MS 分析结果Tab.2 Analysis results of various constituents in the stems of G.jasminoides by LC-MS

本实验所鉴定的萜类多数为小分子单萜及倍半萜，这类小分子极性较弱，主要通过二级碎片及数据库匹配进行鉴定，如峰7、20、21、22、23、25。此外，还鉴定了极性萜类化合物，峰4 在上述条件下可观察到m／z373 的母离子，以及丢失一个葡萄糖分子m／z162 后的碎片离子m／z211，结合质谱数据库、文献［18］、对照品比对，鉴定为京尼平苷酸；峰29 和30 显示相同的母离子m／z475［M+H］+，提示两者为一对同分异构体，二级质谱显示有m／z249、203、109 等碎片信息，通过二级数据库匹配及对照品比对，分别鉴定为齐墩果酸和熊果酸。

峰8 可见m／z353 母离子碎片，其二级质谱碎片中存在m／z161 碎片离子，对应其咖啡酸片段中丢失水分子后的碎片特征，经质谱数据库、文献［19］、对照品比对，鉴定为绿原酸。另外，其他类小分子芳香化合物的结构鉴定主要是通过将其质谱一级数据、二级碎片离子信息与标准数据库匹配完成。

2.7 含量测定

2.7.1 HPLC 色谱图 在“2.3”项条件下进样，结果见图2～3。

图2 对照品各成分HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents in reference substance

2.7.2 样品含量测定 取同一批样品粉末1.0 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样10 μL，计算含量。结果，去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、去甲基川陈皮素、栎精-3，7，3′，4′-四甲醚质量分数分别为2.140、0.665、3.575、0.003、0.164、0.001、0.002 mg／g。

3 讨论

3.1 提取条件优化 为了比较不同提取溶剂的提取效果，以30%、50%、70%、100%甲醇及30%、50%、70%、100% 乙醇作为提取溶剂，分别超声35、45、55 min，并计算提取率。结果发现，在以甲醇为溶剂超声45 min 时，提取率最高。故确定甲醇为溶剂，超声45 min 前处理样品。

3.2 流动相选择 分别采用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1%磷酸进行等度和梯度洗脱。结果表明，在乙腈-0.1%磷酸溶液的流动相中，各色谱峰分布、峰形和分离度均优于甲醇-水（酸水）系统。因此，最终选择乙腈-0.1% 磷酸溶液为流动相。

3.3 色谱条件及波长选择 基于文献［20］报道方法，对本实验的色谱条件进行优化。实际样品分析中，在33% 乙腈洗脱下，所有环烯醚萜类成分均已出峰。对于检测波长的选择，由于单一波长难以全面反映栀子枝中化学成分组成的全貌，故本实验采用DAD 检测器对栀子样品进行全波长扫描（200～800 nm），对各波长下的色谱图进行分析比较。结果发现，环烯醚萜类、有机酸类的最大吸收波长分别为254、330 nm，所以本实验检测波长分别选择254、330 nm。

含量测定结果显示，竹节参皂苷Ⅳa 在栀子枝中最高，也比在果中的要高［12］；去乙酰基车叶草苷酸是栀子枝中主要存在的环烯醚萜类成分，含量与栀子果部位相当［20］，其次为京尼平苷酸和栀子苷，而京尼平龙胆双糖苷含量最低。

图3 样品各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents in samples

4 结论

栀子传统以果实入药。目前，相关研究也主要集中在果实部位，有关其他部位的化学成分及资源化分析研究较少。本实验首先对栀子枝中的化学成分进行LC-MS 定性分析，随后对其进行HPLCDAD 定量测定。结果表明，栀子枝成分多样性较为丰富，包含黄酮、萜类及有机酸等多种结构类型，具有一定的研究意义。含量测定结果提示，栀子枝在一定程度上可以作为去乙酰基车叶草苷酸、京尼平苷酸、竹节参皂苷Ⅳa 等化合物的新来源，结合中药材“一体多用”原则，以期为栀子非传统药用部位的开发利用和质量评价提供参考。