运脾消积法治疗厌食症幼龄大鼠的代谢组学

李玉霞 史正刚∗吴丽萍祁 辉陈 静

（1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院儿科，甘肃兰州 730000）

西医认为，小儿厌食症发病因素复杂多样，包括饮食结构不合理、局部或系统性疾病、微量元素缺乏、中枢神经系统、胃肠运动失调、药物和激素类物质影响等［1-3］，而直接机制在于消化酶活性减少、食欲调节中枢失调、摄食调节关键区域功能异常、食欲调节因子分泌紊乱等［4-5］；中医认为，喂养不当、饮食不节是导致小儿脾胃损伤的主要原因，加上脾胃受损、先天不足、后天失养、生活环境等因素及小儿“脾常不足”的生理特点，易造成脾运胃纳功能失健，从而形成厌食［6-7］。长期厌食症将造成小儿营养不良，影响生长发育，导致其免疫力下降，使其他系统疾病的易感性增加。

西医治疗小儿厌食症的方法包括心理辅导、补锌、促进胃肠动力药等，但只能改善症状，不能解决根本问题，并且长期使用会出现一些不良反应；中医治疗方法为运脾法，在临床上取得了较好的疗效，克服了西医片面补锌所带来的不良反应［8］。其中，小儿开胃增食合剂作为运脾法治疗小儿厌食症的代表中药制剂，临床上表现出显著效果［9］，但其干预机制尚不清楚。

研究表明，小儿厌食症患者体内物质代谢可发生明显变化，主要是由于摄食不足导致营养物质供应缺失，使得各细胞、器官、系统代谢失调，并又通过影响自身功能的正常运行而进一步加重症状，形成恶性循环［10］。代谢物作为基因、蛋白网络运行的下游最终产物，其变化可反映上游基因、蛋白水平代谢通路的变化，故本实验通过代谢组学检测尿液中代谢物、代谢通路的变化，探索小儿开胃增食合剂治疗小儿厌食症的作用机制，为相关临床治疗提供数据参考和理论支持。

1 材料

1.1 动物 60 只离乳后1 周龄SPF 级健康SD 大鼠，雌雄各半，体质量（80±10）g，购自甘肃中医药大学动物实验中心，动物使用许可证号SYXK（甘）2015-0005-62001000000354。

1.2 药物 小儿开胃增食合剂（批号甘药制字Z09011932）由甘肃中医药大学附属医院制剂室提供；江中健胃消食片（国药准字Z36021464，批号17031001）购自江中药业股份有限公司。

1.3 仪器 LC-MS 液质联用仪（美国Thermo 公司，型号Ultimate 3000LC，Orbitrap Elite）；低温离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司，型号TGL-16）；超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司，型号DW-HL528）。

2 方法

2.1 造模 采用病因模拟法建立厌食症模型［11］，特制饲料为将鱼肉松、奶粉、玉米粉、黄豆粉、白糖、鲜鸡蛋、鲜肥肉按1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2 比例混匀，制成饼状，晾干，4 ℃下保存。造模组大鼠喂养特制饲料，对照组仅常规喂养，记录每天进食量，以造模组大鼠摄食量平均下降20%～30%、体质量低于对照组10%～15%为造模成功。

2.2 分组及给药 将造模组大鼠随机分为模型组、阳性对照组及小儿开胃增食合剂高、低剂量组，每组12 只，按儿童、大鼠体质量的剂量倍数直接换算成等效剂量，其中小儿开胃增食合剂高剂量组（0.3 g 生药／mL）以11.4 g／kg 剂量灌胃，低剂量组以5.7 g／kg 剂量灌胃；阳性对照组以0.45 g／kg江中健胃消食片溶液灌胃；正常组、模型组以等体积蒸馏水灌胃，每天1 次，连续42 d，

2.3 摄食量、体质量检测 记录每天大鼠体质量、饲料剩余量、当日饲料加入量，每天大鼠摄食量＝前天饲料加入量-当天饲料剩余量，计算大鼠每天摄食量，并在灌胃前后进行对比。

2.4 尿样采集 末次给药结束后，将大鼠置于清洁代谢笼中，在冰上用装有1 mL 0.1% 叠氮化钠（NaN3）的一次性塑料尿杯收集24 h 尿液，移液枪采集1.5 mL 上清液后转移至离心管中，进行编号和记录，-80 ℃下保存备用。

2.5 样品处理 室温下解冻尿液后，取100 μL 至1.5 mL 离心管中，加入甲醇300 μL、2-氯苯丙氨酸（内标）10 μL，混匀后在4 ℃下离心（12 000 r／min）15 min，取200 μL 上清液待测。

2.6 样品分析

2.6.1 色谱条件 Hypergod C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相水（含0.1% 甲酸）（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱，程序见表 1；体积流量0.3 mL／min；柱温40 ℃；进样量4 μL；自动进样器温度4 ℃。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.6.2 质谱条件 正、负离子模式下除了电喷雾电压分别为3.0、3.2 kV，S-Lens RF Level 分别为30%、60%外，其余条件均为加热器温度300 ℃；鞘气体积流量45 arb；辅助气体积流量15 arb；尾气体积流量1 arb；毛细管温度350 ℃。

2.7 统计学分析 本研究根据等量提取后样本混合而成QC 样本的LC-MS 数据重复性来评价仪器稳定性，分析数据质量，并为后续样品预处理参数设定提供依据。依据QC 样本的保留时间和质荷比数据，对Markerview 参数进行设置，再将LC-MS 原始数据导入该软件中进行色谱峰校准，寻找相应色谱峰及离子强度。根据80%原则及去除同位素离子获取有意义的连续性变量，归一化色谱峰总面积。采用SIMCA-P 13.0 软件对上述处理后的数据进行分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA），其中在OPLSDA 分析中得到投射变量影响值（variable importance in projection，VIP），结合在Markerview软件中得到的t检验P值和倍数变化（fold change，FC）值来筛选差异代谢物，并以同时满足VIP＞1，P＜0.05 和FC＞2 为标准筛选差异代谢物。以质谱质荷比或精确分子质量为指标搜索在线数据库Metlin，对代谢差异物进行定性分析。采用Multiple Array Viewer 软件，对包含峰强度信息的已鉴定差异代谢物的数据集进行HCA 分析，并生成热图，并通过Metabolo Analyst 3.0 软件结合相关文献报道对代谢通路进行分析。

3 结果

3.1 大鼠摄食量、体质量 与正常组比较，造模第7 天模型组大鼠摄食量、体质量分别降低37.5%、19.0%（P＜0.05），第28 天分别降低至40.6%、30.0%（P＜0.05），符合厌食症模型标准，提示造模成功［12-13］。见表2。

表2 各组大鼠摄食量、体质量变化（，g）Tab.2 Changes in food intakes and body weights of rats in various groups（，g）

表2 各组大鼠摄食量、体质量变化（，g）Tab.2 Changes in food intakes and body weights of rats in various groups（，g）

注：与正常组比较，∗P＜0.05。

3.2 系统稳定性、重复性试验 对QC 样品的总离子流色谱图（TIC）色谱图进行重叠，结果见图1。由此可知，代表性离子色谱峰强度的RSD 均小于10%，TR 漂移均小于0.25 min，m／z波动范围不超过0.000 007，表明保留时间重复性、仪器稳定性良好，所得结果具有较高的可靠性。

3.3 LC-MS 代谢谱 图2 显示，各组总离子色谱图的轮廓具有一定差异。再采用SIEVE 软件，对正、负离子模式下的色谱数据进行提取和预处理，并在Excel 2010 中进行归一化及后期编辑，最后整理成二维数据矩阵形式，包括保留时间（RT）、分子量（CompMW）、观察量（样本名称）、质荷比（m／z）、可提取物质数（ID）、峰强度等信息。本实验在正离子模式下共得到1 539 个代谢物，负离子模式下得到4 016 个代谢物，将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P 13.0 软件进行多元统计分析，找出组间具有表达差异的物质。

3.4 主成分分析（PCA）图3 显示，正、负离子模式下各组代谢物的总体分布均比较集中，无明显偏离的组，即无法分辨出各组之间代谢变化的总体差异。因此，本研究采用具有更大区分能力的OPLS-DA 进行数据建模。

图1 QC 样品总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of QC samples

3.5 偏最小二乘方判别分析（OPLS-DA）图4显示，与正常组比较，模型组大鼠尿液中代谢物有明显变化；与模型组比较，小儿开胃增食合剂各剂量组大鼠尿液中代谢物有明显变化。选择OPLSDA 模型的VIP＞1，并结合P＜0.05 且log2FC＞1 或log2FC＜-1 作为差异代谢物的筛选标准，结合质荷比或精确分子质量搜索在线数据库Metlin，发现与正常组比较，模型组中明显下调的代谢物有22 个，明显上调的代谢物有7 个，其中显著下调的有11 个［Xanthosine、LysoPE（0∶ 0／20∶ 4）、m-Coumaric acid、cAMP、Palmitic acid、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Phloroglucinol、6-Phosphog-gluconolactone、Tartaric acid、Hexadecanedioic acid］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），无显著上调的（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1）见表3、图 5；与模型组比较，小儿开胃增食合剂低剂量组中明显上调的代谢物有15 个，明显下调的代谢物有14 个，其中显著上调的有3 个（5-Methoxytryptophan、Suberic acid、N-Acetylleucine）（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1），显著下调的有3 个［Oleic Acid、LysoPE（0∶ 0／18∶ 1）、Palmitic acid］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），见表3、图 5；小儿开胃增食合剂高剂量组中明显上调的代谢物有29 个，明显下调的代谢物有19 个，其中显著上调的有10 个（L-Homophenylalanine、Sinapic acid、2-Acetolactic acid、Ricinoleic acid、Suberic acid、3-Indoleacetic Acid、6-Phospho-g-gluconolactone、Oxaloglutarate、Mesaconic acid、N-Acetylleucine ）（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1），显著下调的有6 个 ［LPA（0∶0／18∶0）、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Palmitic acid、Stearic acid、γ-Tocotrienol］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），见表3、图5。

3.6 代谢通路分析及其生物学意义 将有明显差异的代谢物名称及相对色谱峰强度数据导入MetaboloAnalyst 3.0 软件中进行代谢通路匹配分析，结果见图6～7。由此可知，与正常组比较，模型组具有明显差异的29 个代谢物所涉及到的代谢通路有9 条，主要受到影响的通路包括非饱和脂肪酸和脂肪酸生物合成、苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢；与模型组比较，小儿开胃增食合剂低剂量组主要是非饱和脂肪酸和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢通路受到影响，而高剂量组主要是非饱和脂肪酸和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢受到影响，主要涉及到氨基酸代谢、脂质代谢。

图3 各组大鼠代谢物PCA 图Fig.3 PCA plots for metabolites of rats in various groups

图4 各组大鼠代谢物OPLS-DA 图Fig.4 OPLS-DA plots for metabolites of rats in various groups

表3 各组大鼠尿液中14 种生物标志物Tab.3 Fourteen biomarkers in rat urine in various groups

图6 具有明显差异代谢物的代谢通路（ESI-）Fig.6 Metabolic pathways of metabolites with significant differences（ESI-）

4 讨论

本研究采用病因模拟法成功制备了厌食症模型大鼠，通过LC-MS 法对其尿液中代谢物进行代谢组学的分析，发现有29 个代谢物发生了变化，涉及9 条代谢通路；药物干预后，与模型组比较，小儿开胃增食合剂低剂量组、高剂量组大鼠分别有29、48 个代谢物发生变化，分别涉及14、19 条代谢通路，主要是脂质、氨基酸代谢途径。

图7 具有明显差异代谢物的代谢通路（ESI+）Fig.7 Metabolic pathways of metabolites with significant differences（ESI+）

4.1 潜在代谢标志物 模型组大鼠尿液中具有意义的差异代谢物包括Xanthosine、LysoPE（0∶0／20∶ 4）、m-Coumaric acid、cAMP、Palmitic acid、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Phloroglucinol、6-Phosphogluconolactone、Tartaric acid、Hexadecanedioic acid，提示小儿厌食症模型大鼠代谢发生了明显变化，可作为临床诊断和评价的代谢标志物候选因子，但还需利用分子生物学手段证实。

4.2 脂质代谢途径 脂质代谢是机体维持脂类物质平衡，影响机体正常运行的主要代谢之一［14］。本研究发现，模型组大鼠尿液中脂质代谢途径相关物质LPA（0∶ 0／18∶ 0）、Palmitic acid、Oleic Acid、Tartaric acid 水平均显著下降，其中Palmitic acid、Oleic Acid、Tartaric acid 均属于脂肪酸生物合成通路的产物，LPA（0∶0／18∶0）属于甘油磷脂代谢的产物，其浓度下降分别预示体内脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢通路受阻，小儿身体对脂质的吸收、利用、代谢发生障碍，但小儿开胃增食合剂干预后这2 条代谢途径并未发生回调，反而向更失调的方向移动，其原因可能是药物本身对脂质代谢通路的失调作出了贡献，并且也是脂肪酸代谢受阻时机体对高脂高糖饲养的一种保护改变策略。

4.3 氨基酸代谢途径 氨基酸代谢在小儿厌食症模型大鼠中失调，其中苯丙氨酸代谢通路的产物苯乙醛在模型组中下调，而经小儿开胃增食合剂干预后上调。苯丙氨酸作为人体必需的氨基酸，它在模型组中代谢下调可能是由于厌食造成其摄入减少所致，而干预后其代谢上调可能是由于小儿开胃增食合剂可改善症状，使其摄入量趋于正常。

4.4 其他 其他物质代谢及其通路在各组大鼠中呈非线性系统性变化，具体原因还需进一步研究。