复方紫草汤对咪喹莫特所致银屑病小鼠的治疗作用

徐志立，梁晗业，边澈，于彩娜

(辽宁中医药大学，辽宁大连 116600)

银屑病是一种慢性炎症，病程较长，容易复发，以红斑、鳞屑为主要临床表现，患者全身均可发病，以头皮、四肢伸侧较常见，且冬季多加重[1-2]。中医认为，银屑病属血热、血燥、血瘀等证。银屑病初起呈血热，中期(血热后)多为血燥；出现血瘀时患者基本在银屑病后期，病情较严重[3]。中医临床中，采用清热凉血、解毒祛风方剂内服，或清热燥湿、活血祛风、消炎止痒、抑菌杀菌、剥脱角质和促成角质的方药外用均取得良好治疗效果[4]。咪喹莫特是Toll样受体激动药，小鼠局部皮肤涂抹咪喹莫特后，可在6～8 d表现典型的银屑病样病理学改变，这种病理变化与人类银屑病有较多相似之处，是研究银屑病的理想动物模型[5-6]。

复方紫草汤源于中医临床验方，是辽宁中医药大学药学院根据中医药理论指导与科学实验制备的内服制剂，由紫草、桂枝、白芍、僵蚕、蝉蜕、白鲜皮、桃仁、炙甘草、白花蛇舌草、焦山楂十味中药配伍而成。方中紫草清热解毒，凉血活血，既清解血分热毒，又防止热与血结成瘀，兼滑肠利尿，导毒热从二便分消，为君药。白花蛇舌草、白鲜皮助紫草清解热毒，并利湿燥湿，防热壅湿聚，白鲜皮又止痒；桃仁助紫草活血祛瘀、滑肠通便；白芍养血补阴，既可治血虚之本，又防血热伤阴，共为臣药。僵蚕、蝉蜕辛散祛风、止痒；焦山楂消食化瘀；桂枝通行血脉，防止全方药物寒凉凝遏，共为佐药。炙甘草和中调药，为使药。

本研究以咪喹莫特所致小鼠银屑病模型为研究对象，分析复方紫草汤对银屑病的治疗作用，并探讨其作用机制，为新药开发和临床应用提供参考。

1 材料

1.1 动物

昆明种小鼠，体质量25～35 g，雌雄各半，购自本溪长生生物技术股份有限公司，许可证号SCXK(辽)2015-0001，适应性饲养3 d，正常饮食。所有实验操作符合辽宁中医药大学实验动物伦理审查委员会要求。

1.2 药物及试剂

桂枝、白芍、白僵蚕、蝉蜕、白鲜皮、紫草、桃仁、炙甘草、白花蛇舌草、焦山楂(大连东特大药房)，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室张慧教授鉴定为正品。5%咪喹莫特乳膏(珠海联邦制药股份有限公司，批号8020750)；甲氨蝶呤(上海上药信谊药厂有限公司，批号036170804)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(江苏科特生物技术有限公司，批号18051332M)。

1.3 仪器

石蜡切片机(德国莱卡)；显微载玻片及组织包埋盒(江苏世泰试验器材公司)；GH显微镜(日本奥林巴斯)；TG16-WS台式高速离心机(湖南湘仪仪器公司)；MR-96A酶标仪(深圳迈瑞公司)；XW-80A涡旋混合仪(海门市其林仪器公司)。

2 方法

2.1 复方紫草汤的制备

取桂枝10 g、白芍20 g、僵蚕10 g、蝉蜕10 g、白鲜皮10 g、紫草10 g、桃仁10 g、炙甘草15 g、白花蛇舌草30 g、焦山楂10 g，沸水提取2次。第1次加10倍蒸馏水浸泡30 min，煮沸，然后文火30 min，过滤；第2次加8倍蒸馏水提取；合并滤液，浓缩至42 mL，即得浓度3.2 g/mL复方紫草汤。

2.2 小鼠银屑病模型的建立

小鼠在清洁级环境中饲养，温度(22±2)℃，相对湿度40%～60%，控制照明时间为14 h。适应1周后开始实验。取60只小鼠随机分为正常对照组，模型对照组，甲氨蝶呤组，复方紫草汤高、中、低剂量组6组，每组10只。各组小鼠脱去背毛4 cm2，正常对照组脱毛处仅外涂凡士林，其余各组小鼠涂抹咪喹莫特乳膏，每次10 mg，每日2次，连续14 d。观察各组小鼠每天皮损变化情况，参考文献[7]依据皮损严重程度评分标准对小鼠相应红斑、鳞屑及浸润增厚程度进行评分，三者总和即为小鼠皮损严重程度评分。评分标准见表1。

表1 银屑病皮损严重程度评分标准

2.3 给药

各组小鼠于造模第15 d开始灌胃给药。高、中、低剂量组分别给予32 g/kg、16 g/kg、8 g/kg的复方紫草汤，阳性对照组给予甲氨蝶呤2.5 mg/kg，正常对照组和模型对照组小鼠给予等体积蒸馏水，每天1次，连续给药14 d。

2.4 复方紫草汤对银屑病小鼠临床症状的缓解作用

造模及给药期间，每周测定各组小鼠皮损严重程度评分及小鼠体质量。实验第28天(给药第14天)，取血离心，按试剂盒说明书ELISA法测定TNF-α含量。处死小鼠，取背部皮损处皮肤，4%多聚甲醛固定24 h后，依次经脱水与透化、组织浸蜡、石蜡包埋、切片、贴片与烤片、脱蜡与水化、苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水与透明、封固，光学显微镜观察组织病理变化，拍照记录。

2.5 免疫组化法测定银屑病小鼠皮肤组织中TNF-α的表达

皮肤组织4%多聚甲醛处理，24 h后修整组织块，依次放入70%、80%、90%、95%乙醇各2 h，100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ 1.5 h 脱水。二甲苯中透明20 min。56 ℃石蜡浸蜡6 h，包埋，修整蜡块，备用。将包埋好的石蜡块置于切片机上连续5 μm切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，烘烤24 h(60 ℃)，依次经脱水、脱蜡、修复、一抗孵育、冲片、二抗孵育、显色等步骤，观察银屑病小鼠皮肤组织中TNF-α的表达。Image J 1.52软件扫描免疫组化切片，测定平均光密度(average optical density，AOD)，以正常组AOD值为100%，其他组与正常组比较，获得相对光密度(relative average optical density，RAOD)。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 复方紫草汤对银屑病小鼠临床症状的影响

与正常对照组比较，给予小鼠咪喹莫特软膏后，体质量增长有抑制趋势，但差异无统计学意义。各组小鼠给予不同剂量复方紫草汤后，对于小鼠体质量均未见显著影响。见表2。咪喹莫特涂抹7 d后，各组小鼠皮肤出现明显红斑，皮肤持续增厚，类似银屑病样皮损，继续涂抹14 d，银屑病症状加重。各组给予不同剂量复方紫草汤及甲氨蝶呤14 d后，皮损症状明显减轻，与模型组所示大面积深红色斑块、皮肤增厚比较，各给药组皮损症状减轻，鳞屑较少，尤其高剂量组小鼠皮肤较光滑，鳞屑稀少，浸润增厚明显减轻。见表3～表6及图1。

表2 复方紫草汤对银屑病小鼠体质量的影响 g

表3 复方紫草汤对银屑病小鼠皮肤肥厚程度评分的影响(n=10) 分

表4 复方紫草汤对银屑病小鼠皮肤鳞屑评分的影响(n=10) 分

表5 复方紫草汤对银屑病小鼠皮肤红斑评分的影响(n=10) 分

表6 复方紫草汤对银屑病小鼠皮损程度总分的影响(n=10) 分

图1 给药后各组小鼠皮损情况

3.2 复方紫草汤对银屑病小鼠皮肤组织形态学的影响

各组小鼠病变部位皮肤经组织切片HE染色后，镜下观察皮肤组织学变化情况见图2。正常对照组小鼠的皮肤结构完整，表皮未见角化过度和角化不全，表皮颗粒层清晰，真皮周围无炎性细胞浸润；与正常对照组比较，银屑病模型对照组小鼠的表皮层不同程度角化过度，棘层肥厚，真皮层内血管扩张充血、水肿伴炎性细胞浸润。复方紫草汤高剂量组及甲氨蝶呤阳性对照组，镜下可见表皮结构完整，无明显角化过度，棘层无明显增厚，真皮层内未见血管扩张充血及水肿。复方紫草汤中、低剂量组皮肤组织形态变化程度介于模型组与高剂量组之间。

图2 各组小鼠给药后皮肤组织形态学改变(×100)

3.3 复方紫草汤对银屑病小鼠TNF-α表达的影响

咪喹莫特所致银屑病小鼠血浆中TNF-α含量显著升高，给予16 g/kg、32 g/kg复方紫草汤及2.5 g/kg甲氨蝶呤后TNF-α含量显著降低。TNF-α免疫组织化学染色反映表皮细胞增殖程度，阳性反应物经DAB显示呈棕色颗粒。正常对照组TNF-α几乎没有表达，而咪喹莫特所致银屑病模型小鼠皮损中TNF-α表达明显增多，染色呈深棕色，RAOD高于正常组(P<0.01)；复方紫草汤中、低剂量组部分黏膜及黏膜下细胞呈阳性反应，染色较高剂量组更深，RAOD与模型组比较明显降低(P<0.01)。见表7，图3、图4。

表7 复方紫草汤对银屑病小鼠血浆TNF-α含量的影响 ng/L

图3 各组小鼠TNF-α免疫组化染色情况

注：△与正常对照组比较，P<0.01；*与模型组比较，P<0.01

4 讨论

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，典型皮损为边界清楚的红斑、斑块，上覆银白色鳞屑[8]。银屑病的患病率在世界各地差异较大，与种族、地理位置、环境等因素有关。在世界范围内发病率为0.1%～3.0%，不同国家的发病率差异也较大，欧美国家发病率高达3%，我国银屑病发病率为0.47%，约有500万患者。银屑病及其并发症对患者生理、心理、日常活动和家庭相处均造成严重影响[9]。

银屑病发病机制复杂，涉及遗传、感染、免疫、神经精神、内分泌等各种因素，但根本上银屑病为免疫介导的器官特异性自身免疫性疾病。T细胞异常的活化和浸润是其发病主要环节。T细胞可通过多种途径诱导正常角质形成细胞过度增殖，并促进细胞因子释放，进而增强T细胞活性状态，同时细胞因子还影响表皮增生及凋亡调控基因的表达，最终导致银屑病皮损表现[10]。实验结果显示，复方紫草汤可明显缓解咪喹莫特诱导的角质化和细胞固化现象，显著抑制咪喹莫特引起的银屑病样皮肤损伤。

细胞因子作为免疫调节的物质基础在银屑病的发病中起重要作用[11]。TNF-α与银屑病免疫炎症反应密切相关，其不仅诱导皮肤内黏附因子表达，促进淋巴细胞的浸润，还可促进朗格汉斯细胞的成熟，增强其活化T细胞的能力[12]。本研究结果表明，模型组小鼠血浆中TNF-α水平明显高于正常对照组，复方紫草汤对小鼠体内TNF-α表达具有抑制作用，其中高、中剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

总之，复方紫草汤可能通过下调TNF-α表达水平发挥治疗银屑病的作用，有关其具体机制和信号转导途径仍需要进一步研究。