气相色谱法测定水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量

胡浩光，刘少彬，郭楚仪，姚婉仪，谢翠美

(东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523002)

五氯苯酚(Pentachlorophenol)是一种中等毒性的农药。中毒之后因心力衰竭和交热引起死亡,它能抑制细菌的腐蚀作用、阻止真菌的生长是重要的防腐剂,一直以来被用作木材和皮革品的防霉剂，其钠盐用于消灭血吸虫中间宿主钉螺[1]，也是土壤杀菌剂和拌种剂，用于防治小麦腥黑穗病，马铃薯痂疮病，棉花立枯病等，目前PCP和NAPCP是最佳、最廉价的药剂，在发展中国家产生很大的收益，作为清塘药物被广泛用于池塘。PCP和NAPCP是我国主要的污染物之一，因其化学性质稳定，不易降解，是一种遗传毒性物质，导致基因突变和染色体畸变，对生殖细胞和胚胎有致突变、致畸风险[2]，而且有较高的水溶性，通过水载体扩散，最终危害人体健康。我国农业部2002年发布《无公害食品渔用药物使用准侧》，明确规定动物生产中禁用五氯苯酚。对于五氯苯酚的检测方法，主要有GC法[3]、生物膜电极法[4]、毛细管区带电泳法[5]、LC法[6]、气质联用法[7]、LC-MS-MS法[8]、分光光度法9]等。气相色谱法和高效液相色谱法是水产品检测采用的主要方法。本文研究建立的水产品中五氯苯酚及其钠残留量测定的气相色谱法，操作简便、灵敏度高，检测结果准确。

1 材料与方法

1.1 标准品与试剂

五氯苯酚标准品，购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度99%以上；正己烷为色谱纯，均购自Fisher scientific飞世尔实验器材(上海)有限公司；试验用水为超纯水，购自东莞市怡丰贸易有限公司，18.2 MΩ·cm；无水硫酸钠(650 ℃灼烧4 h，冷却后置干燥器内中备用)为分析纯；硫酸为优级纯，购自广州化学试剂厂；碳酸钾为分析纯，购自广州化学试剂厂,实验用水为Milli-Q制备的超纯水。

1.2 仪器与设备

气相色谱7890,美国安捷伦公司；冷冻离心机,德国SIGMA公司；电子天平(感量0.0001),德国SARTORIUS公司: 电子天平(感量0.01),赛多利斯公司；MS1涡旋振荡器,德国IKA公司；超纯水仪,美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

将水产品可食部分，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，打成肉糜混合均匀，待测或放置冰箱中冷藏备用。

1.3.2 样品提取

称1.00 g试样于50 mL具塞聚乙烯离心管中，加入8 mL硫酸-水(1:1)，旋涡混合器混合1 min，80 ℃水浴半个小时，冷却后加10 mL正己烷，旋涡混合器混合3 min，10000 r/min离心5 min。抽取上层正己烷提取液于50 mL离心管中。

1.3.3 净 化

向提取液中加8 mL碳酸钾溶液，旋涡混合2 min，充分混合提取，10000 r/min离心5 min，吸出下层提取液到15 mL具塞离心管中。

1.3.4 衍生化

向碳酸钾提取液中加0.2 mL乙酸酐，振摇1 min并不断放气，加入4 mL正已烷萃取，旋涡混合2 min，充分混合提取，10000 r/min离心5 min，正己烷提取液提取液移于5 mL容量瓶中，用正己烷定容至5.0 mL，混匀后经装有2.0 g的无水硫酸钠柱脱水，取1.0 mL供气相色谱分析用。

1.4 气相色谱测定

1.4.1 气相色谱测定条件

色谱柱：HP-5石英毛细管柱(30 m×0.320 mm×0.25 μm)，进样量1 μL。脉冲分流进样，分流比40:1，脉冲压力为10 psi,脉冲时间为0.75 min。升温程序为:初温140 ℃，保持1 min；10 ℃/min至200 ℃，保持5 min，然后设定30 ℃/min升至260 ℃，保持2 min。进样口温度260 ℃，检测器温度为300 ℃。载气为氮气，流速1.2 mL/min。外标法定量。

1.4.2 标准溶液的配制

准确称取0.0100 g五氯苯酚标准品，用碳酸钾溶液定(0.1 mol/L)容至100.0 mL，配制成100 ug/mL的标准储备液。使用时用0.1 mol/L K2CO3溶液进行梯度稀释，配制分别含0.5 μg/L、1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、50.0 μg/L、75.0 μg/L、100.0 μg/L的标准工作液，各取5.0 mL,分别置于15 mL具塞离心管中，加入3 mL碳酸钾溶液，按1.3.4步骤操作。

2 结果与讨论

2.1 提取优化

向南美白对虾样品(1.00 g)中，加入100 μL PCP 浓度为100.0 μg/L标准工作液，涡旋混匀，硫磺化后，80 ℃水浴0.5 h，分别采用10 mL正己烷、10 mL×2次正己烷和10 mL×3次正己烷提取，平行6个，按1.3.4步骤操作，比较增加提取次数对回收率的影响，试验结果表明，正己烷提取一次回收率结果，适合大批量水产品检测要求(表1)。

表1 正己烷提取次数对五氯苯酚回收率的影响Table 1 The effects of n-hexane extraction times on recoveries(n=6)

2.2 衍生化条件优化

2.2.1 衍生化pH条件的确定

当pH<6时，未形成酚离心，降低了乙酰化产率，当pH>11.5时，乙酸酐的水解快于乙酰化反应，pH为9～11是乙酸酐乙酰化的最佳反应。由于试验的时候有酸生成，因此用0.1 mol/L K2CO3作为敷酸剂，满足衍生条件。

2.2.2 衍生试剂的用量

取5.0 mL PCP 浓度为5.0 μg/L标准工作液6份，分别加入0、20、50、100、200、300 μL乙酸酐,按1.3.4条件处理，结果显示，衍生试剂为200 μL时，乙酰化反应趋于最高点(图1)。

图1 PCP-OAc 峰面积与乙酸酐用量的关系Fig.1 The relation between peak area of PCP-OAc and dosage of acetic anhydride

2.3 色谱图

五氯苯酚衍生后生产五氯苯乙酸酯，稳定性和挥发性均有增加，按1.4.1色谱条件进行测定，图2为PCP-OAc标准品色谱图；图3为南美白对虾空白样品和南美白对虾添加0.2 mL 50 ng/mL PCP的加标样品色谱图。

图2 PCP-OAc标准品色谱图(10 ng/mL)Fig.2 The chromatogram of PCP-OAc standard solution(10 ng/mL)

图3 南美对虾空白样品(A)和10 ng/mL加标样品(B)的色谱图Fig.3 The chromatogram of blank South America prawns sample(A) and 10 ng/mL spiked sample(B)

2.4 线性范围和检出限

PCP标准工作液经乙酸酐衍生化后上机测定,测定其峰面积相应值,以峰面积对应的质量浓度做工作曲线。进样量为1 μL 时，PCP-OAc在质量浓度为0.5～100.0 ng/mL的范围内呈良好的线性关系,线性方程为Area=666600106*Amt+0.8193952,线性系数r=0.99996。本方法测定条件下，按样品中添加PCP水平为2.0 μg/kg，以信噪比S/N=3所对应的浓度为依据计算检出限，得到五氯苯酚的检出限为0.7 μg/kg。

3 回收率及精密度

取阴性样品，分别加入浓度为2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、和10.0 μg/kg标样，每组水平7次平行样，按上述实验条件，测定加标回收率，数据见表2所列。五氯苯酚的回收率在82.5%～92.3%之间，重复性较好， RSD值为3.6%～12.3%，因此该方法的准确度和精确度均可以满足测定要求。

表2 不同水产品的加标回收率Table 2 Recovery rates of MG in different samples

4 结 论

本实验建立水产品中的五氯苯酚气相色谱检测方法，用正己烷萃取,再用碳酸钾溶液反萃取,萃取物以乙酸酐衍生,生成衍生物五氯苯酚乙酸酯，再用正己烷萃取,用气相色谱(配备电子捕获检测器)测定，不同浓度的加标，回收率在82.5%～92.3%，检出限为0.7 μg/kg。结果表明：通过实验表明，该方法切实可行，适用水产品五氯酚钠及其钠盐残留量的检测。