鱼油中棕榈油酸的分离纯化

曹亚伦，戴志远，2*，沈 清，2，陶美洁，李思敏，叶 繁

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012）

棕榈油酸（C16：1n7，Palmitoleic acid）是一种16 碳的ω-7 系单不饱和脂肪酸。近年来，随着对鱼油研究的深入，相对于脂肪酸中的“明星”ω-3系脂肪酸而言，鲜为人知的ω-7 系列脂肪酸也逐渐受到关注，它和ω-3 一样有很多健康益处，还具有一些ω-3 没有的功能。棕榈油酸是自然界中最常见的ω-7，它具有独特的功效，是保健市场上的一种新产品。ω-3 具有预防心血管疾病和促进神经发育等功效[1]。与ω-3 脂肪酸相比，ω-7 有着不同的作用机制，ω-7 脂肪酸能起激素样作用[2-3]，刺激肌肉胰岛素，促进葡萄糖代谢并抑制脂肪的形成[4-6]，从而改善人体健康状况[7-9]。可见棕榈油酸在医疗保健领域有着广阔的应用前景。

棕榈油酸在常见的油料作物中含量较低，而在澳洲坚果油中含30%[10]，沙棘果油中含35%[11]。有报道称猫儿屎籽（Decaisnea insignis）油中棕榈油酸的含量达55.9%，植物猫爪（Dolichandra unguis）含量约64%[12]。棕榈油酸存在于一些种子油中，从种子油及沙棘油中分离棕榈油酸价格昂贵，且其供应不足以满足市场需要，需寻找新的棕榈油酸来源。深海鱼油为ω-3 系脂肪酸的最主要来源，也是棕榈油酸的来源。目前鱼油工业主要以分离ω-3 系多不饱和脂肪酸为主，以鱼油为原料生产的棕榈油酸较少。目前国内关于棕榈油酸富集的研究大多以沙棘果油为原料[13-15]，而从鱼油中富集棕榈油酸的研究暂未见报道。本试验使用的原料——秘鲁鳀油含约8%的棕榈油酸，因此以鳀鱼油为原料进行棕榈油酸初步分离富集研究，为生产更高纯度棕榈油酸提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鱼油，秘鲁进口精制鳀鱼油，由浙江海力生集团有限公司提供。95%乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯）、正己烷（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸钠（分析纯），西陇化工股份有限公司；棕榈油酸乙酯标品（色谱纯），美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪（7890A），美国Aglilent 公司；电子天平（AL204 型），梅特勒－托利多有限公司；定时恒温磁力搅拌器（JB-3 型），上海雷磁新泾仪器有限公司；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ），郑州长城科工贸有限公司；分子蒸馏设备，天津市金舜尧化工设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼油脂肪酸乙酯的制备[16]称取一定量的鳀鱼油于三颈烧瓶中，水浴加热至50 ℃，加入一定量的氢氧化钠-乙醇溶液（m/m=0.02∶1），醇油比（无水乙醇/鳀鱼油）为3∶5（m/m），水浴搅拌加热75 min。反应结束后将混合物倒入分液漏斗，然后用适量5%NaCl 溶液洗3 次，静置至液体分层，去下层水相层。取上层含油相于60 ℃旋蒸除尽乙醇，加入一定量无水硫酸钠除去水分，过滤得到鳀鱼油混合脂肪酸乙酯。

1.3.2 鱼油脂肪酸组分分析[17]称取约1 g 乙酯化鱼油于15 mL 容量瓶中，加入一定量的正己烷溶解鱼油，用正己烷定容至刻度线，摇匀。取1 mL上述溶液用有机膜过滤到样品瓶中，做气相色谱分析。

色谱条件：HP-88 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.20 μm）；柱箱温度，初始温度70 ℃，后运行温度100 ℃，以15 ℃/min 的速率升至150 ℃，再以3 ℃/min 的速率升至220 ℃保持5 min；进样量1 μL；进样口温度250 ℃；检测器温度280 ℃；燃气为高纯氢气，助燃气为空气，尾吹气为氮气。

1.3.3 尿素包合法[18]尿素包合法是一种根据脂肪酸饱和度的不同将其分离的方法。其原理是尿素在结晶过程中形成具有一定空间体积的晶体，饱和脂肪酸不含双键，直径较小，易与尿素分子形成稳定的包合物；不饱和脂肪酸含有双键会使其碳链弯曲，其碳链占据较大的体积空间，难与尿素形成包合物。使用尿素包合法可以除去大部分饱和脂肪酸，从而提高棕榈油酸含量。

将尿素和95 乙醇按比例（尿素∶乙醇=1∶2，g/g）混合，在75 ℃下水浴搅拌加热直至尿素全部溶解，加入鱼油（鱼油∶尿素=1∶2，g/g）继续搅拌加热，回流1 h 使脂肪酸和尿素充分混匀，置低温下包合结晶。包合结束后迅速抽滤，将滤液旋蒸浓缩除去乙醇，用热水洗涤，分离出上层有机相。对抽滤后的尿包相加入热水破坏尿素鱼油络合物，其中的脂肪酸被释放出来，再用热饱和食盐水洗至下层澄清，取上层脂肪酸。通过气相色谱分析非尿包相与尿包鱼油产物的脂肪酸组成。

1.3.4 分子蒸馏试验[19]在分子蒸馏设备的出料口上装上配套的接收烧瓶，在接收烧瓶口涂抹密封脂保证系统密闭性，打开真空泵、增压泵和冷凝水，打开加热器加热导热油，打开热油泵将热油运送至蒸发面处；将乙酯化鳀鱼油200 g 放入设备的进样口，待设备的真空度和蒸发温度达到要求后，调节刮膜转速和进料速度开始进样，考察不同的蒸馏温度、刮膜转速、进料速度对分离样品中棕榈油酸的影响。在单因素试验的基础上，应用响应面分析优化分子蒸馏富集棕榈油酸的操作条件。

2 结果与分析

2.1 原料鱼油的脂肪酸组成

将棕榈油酸乙酯标准品和乙酯化鱼油用气相色谱仪分析，得到其脂肪酸组成及其占总脂肪酸比例，结果见图1、图2 与表1。

图1 对棕榈油酸标品的气相色谱分析表明，在试验条件下棕榈油酸出峰时间为9.57 min。从图2 和表1 可看出，原料鱼油中棕榈油酸属于单不饱和脂肪酸，占总脂肪酸的8.41%。鱼油中饱和脂肪酸占39.92%，其中C16：0占总脂肪酸的23.54%，单不饱和脂肪酸占25.34%，多不饱和脂肪酸占28.33%；中C20：5占总脂肪酸的15.47%。在富集试验中主要除去以C16：0为主的饱和脂肪酸和以C20：5为主的多不饱和脂肪酸。利用不同分离技术将这2 类脂肪酸去除。在本试验中采用尿素包合法与分子蒸馏技术。

图1 棕榈油酸乙酯标品气相色谱图Fig.1 GS of palmitoleic acid ethyl ester

图2 原料鱼油气相色谱图Fig.2 GS of fish oil

表1 原料鱼油的脂肪酸组成及含量Table 1 Fatty acid composition and content of raw fish oil

2.2 尿素包合处理对鱼油脂肪酸的影响

尿素包合法是利用尿素分子在结晶过程中可与饱和、单不饱和脂肪酸形成包合物，而不易与多不饱和脂肪酸包合的原理，达到对多不饱和脂肪酸分离纯化的目的。原料鱼油经乙酯化处理后，采用尿素包合法富集其中的棕榈油酸乙酯，得到非尿包相和尿包相，进气相色谱分析，结果见图3、图4 与表2。

原料鱼油经尿素包合法处理得到的产物非尿包相中棕榈油酸的含量由8.41%提升至13.57%，得率为60.1%。气相色谱分析表明（见表2 和图4），尿素包合可除去大部分的饱和脂肪酸C14：0、C16：0及C18：0，只损失少量的棕榈油酸，这是因为尿素包合法是根据不饱和度的差异实现分离的，尿素遇到脂肪化合物会形成六棱晶体结构，直链的饱和脂肪酸比碳链弯曲的不饱和脂肪酸更易进入尿素晶体管道内，因此尿素包合法可以有效除去饱和脂肪酸[20]。

2.3 分子蒸馏单因素试验

2.3.1 刮膜转速对富集效果的影响 刮膜转速是影响分子蒸馏富集效果的因素之一。此次试验所采用的分子蒸馏条件为：设备真空度3.0×10-3kPa，进料速度1 mL/min，蒸馏温度70 ℃。在此条件下考察不同刮膜转速对棕榈油酸富集的影响，如图5所示。

图3 尿包相气相色谱图Fig.3 GS of urea phase

图4 非尿包相气相色谱图Fig.4 GS of non-urea phase

表2 非尿包相与尿包相的主要脂肪酸组成及含量Table 2 Main fatty acid composition and content of non-urea phase and urea phase

由图5 可知，在蒸馏温度70 ℃时，随着刮膜转速的加快，棕榈油酸含量提高，直至转速达140 r/min 后棕榈油酸含量没有明显提高，这是因为当刮膜转速较低时，从进料口进入的鱼油在重力和刮膜的作用下不能完全均匀地分布在蒸发表面上，低沸点组分不能完全蒸发到达冷凝器，冷凝流入轻相接受瓶中，从而导致分子蒸馏分离效果不佳。当刮膜转速加快，低沸点组分得以蒸发，分离效果有所提升。当刮膜转速大于140 r/min 时，棕榈油酸富集效率没有明显增加，是因为此刮膜转速足以使物料在蒸发表面上形成均匀的液膜，使轻组分得以完全蒸发出来。由上述结果可知，刮膜转速对物料的分离效果影响不明显，最终确定适合的刮膜转速为140 r/min。

2.3.2 进料速度对富集效果的影响 进料速度是影响分子蒸馏富集效果的因素之一。本试验的分子蒸馏条件为：刮膜转速140 r/min，设备真空度3.0×10-3kPa，蒸馏温度70 ℃。在此条件下考察不同进料速度对棕榈油酸富集的影响，结果见图6。

由图6 可知，在进料速度大于1 mL/min 时，随着进料速度的加快，轻相中棕榈油酸的含量有所降低，变化不大，而轻相得率不断降低且变化明显，这是因为进料速度快时，物料在刮膜作用下形成的液膜过快地流过蒸发面，物料得不到足够的时间加热，轻组分难以完全蒸发出来，且蒸发面上的液膜较厚，液膜外层也不能充分加热，从而导致分子蒸馏的分离效果不理想，轻组分的得率低。考虑到进料速度过慢使整个操作时间过长，将进料速度设定为1 mL/min。

2.3.3 蒸馏温度对富集效果的影响 蒸馏温度是分子蒸馏富集效果的决定性因素，因不同脂肪酸在高真空度下的沸点不同，故蒸馏温度决定脂肪酸的分离效果及得率。本试验的分子蒸馏条件为：刮膜转速140 r/min，设备真空度3.0×10-3kPa，进料速度1 mL/min。在此条件下考察一级分子蒸馏温度对棕榈油酸富集的影响，结果见图7。

由图7 可知，当蒸馏温度低于65 ℃时，随着温度的升高轻相得率和棕榈油酸含量都增大，这是因为此温度下含有棕榈油酸的轻组分脂肪酸不断被蒸馏出来，到65 ℃时大部分棕榈油酸被蒸馏出来进入轻相，而多不饱和脂肪酸等因温度不够流入重相。当蒸馏温度在65～75 ℃时，随着蒸馏温度的升高，收集的轻相中棕榈油酸含量不断降低，轻相得率提高，这是因为蒸馏温度过高多不饱和脂肪酸也被蒸馏出来，随着温度的升高多不饱和脂肪酸进入轻相。最终确定合适的分子蒸馏温度为65 ℃。

图5 刮膜转速对分子蒸馏的影响Fig.5 Effect of scrape speed on molecular distillation

图6 进料速度对分子蒸馏的影响Fig.6 Effect of feed rate on molecular distillation

图7 蒸馏温度对分子蒸馏的影响Fig.7 Effect of temperature on molecular distillation

2.4 响应面法优化分子蒸馏工艺

2.4.1 响应面试验设计 选择对产物棕榈油酸含量影响显著的3 个因素：蒸馏温度（X1）、进料速度（X2）、刮膜转速（X3）做三因素三水平的响应面试验，得到分子蒸馏的最优条件。

通过Design-Expert 软件进行二次响应面回归分析，得到如下多元二次响应面回归模型：

Y=31.56+2.43X1-2.03X2+0.81X3+0.29X1X2-0.45X1X3+0.36X2X3-6.03X12-1.11X22+0.098X32。

表3 试验设计因素与水平表Table 3 Experimental design factors and levels

表4 响应面试验方案及结果表Table 4 Experiment schemes and results of the response surface

由表5 可知，模型的F 值为73.82，P＜0.0001，表明该模型显著，可用于试验。3 个影响因素中——蒸馏温度（X1）和进料速度（X2）的影响显著（P＜0.001），3 个交互项的影响不显著，二次项X12的影响极显著（P＜0.001），说明产物的棕榈油酸含量主要受蒸馏温度和进料速度的影响。试验校正决定系数R2Adj=0.9718，表明该试验中棕榈油酸含量97.18%的可能性包含在回归方程模型的9 个因子中，说明模型合适。另外，R2=0.9852，说明在棕榈油酸含量的实际值与模型的预测值有较好的拟合度。CV=2.53%，该值低表示该试验准确，可靠性高。

表5 回归模型方差分析表Table 5 The result of regression model of variance analysis

（续表5）

2.4.2 响应面图分析结果 分析得出的响应面图见图8。

从图8 可看出，刮膜转速与进料速度的交互作用对棕榈油酸含量的影响最弱。与刮膜转速相比，进料速度所对应的曲面坡度较陡，说明进料速度的变化对棕榈油酸含量的影响较明显。随着进料速度的减慢，棕榈油酸含量有所提高，这是因为进料速度减慢有利于在蒸发面上形成更薄的液膜，有利于轻组分蒸发出来，从而提高棕榈油酸含量。刮膜转速和进料速度与蒸馏温度的交互作用对棕榈油酸含量的影响显著。与进料速度和刮膜转速相比，蒸馏温度所对应的曲面坡度较陡，表明蒸馏温度对棕榈油酸含量的影响显著。

2.4.3 最优条件及验证 利用Design-Expert 软件对响应面试验结果进行分析，得到分离棕榈油酸的最优条件：蒸馏温度65.74 ℃，刮膜转速160 r/min，进料速度0.63 mL/min，同时产物中的棕榈油酸含量达到最大值33.23%。

采用优化条件对鱼油进行分子蒸馏并测定其棕榈油酸含量，判断优化条件是否准确。实际试验时适当调整最优条件，即蒸馏温度65 ℃，刮膜转速160 r/min，进料速度0.5 mL/min，最终测得产物中的棕榈油酸含量为32.29%，与预测的取代度近似，说明模拟条件可行。

图8 两因素交互作用对棕榈油酸含量的影响Fig.8 Effect of interaction of two factors on Palmitoleic acid content

2.5 尿素包合及分子蒸馏后鱼油中棕榈油酸乙酯含量

原料鱼油首先经尿素包合法处理，除去大部分饱和脂肪酸，然后在单因素试验的基础上，应用响应面分析优化得到分子蒸馏富集棕榈油酸的最优条件。采用气相色谱分析分子蒸馏收集的鱼油的脂肪酸组成，测定棕榈油酸含量。经尿素包合和分子蒸馏处理，鱼油中主要脂肪酸的组成变化见图9、表6。

从表6 可看出，尿素包合处理主要除去饱和脂肪酸，使产物中的棕榈油酸含量由8.41%提至13.57%，得率60.1%。然后分子蒸馏处理，主要除去EPA 和DHA 等长链多不饱和脂肪酸，使鱼油中棕榈油酸的含量由13.57%提至32.29%。分子蒸馏后收集的轻相得率26.29%，棕榈油酸乙酯的回收率60.5%。

图9 分子蒸馏产物的气相色谱图Fig.9 GS of molecular distillation product

表6 原料鱼油经两次处理后其产物的脂肪酸组成及含量Table 6 Fatty acid composition and content of fish oil product

3 结论

利用尿素包合法和分子蒸馏分离特性的不同对鱼油中的棕榈油酸进行富集。首先通过尿素包合处理，在反应温度75 ℃，m鱼油∶m尿素∶m乙醇=1∶2∶4 的条件下，产物中棕榈油酸的含量由8.41%提至13.57%，得率60.1%。然后分子蒸馏处理，在单因素试验的基础上，应用响应面分析优化得到分子蒸馏富集棕榈油酸的最优条件：设备真空度3.0×10-3kPa，刮膜转速160 r/min，进料速度0.5 mL/min，蒸馏温度65 ℃，使鱼油中棕榈油酸的含量由13.57%提至32.29%，得率26.29%。原料鱼油经尿素包合和分子蒸馏，产品中的棕榈油酸乙酯含量从8.41%提到32.29%，回收率为60.5%。