益肾止血颗粒对IgA肾病模型大鼠的影响❋

邹 迪，张守琳△，王银萍，王宏安，刘艳华，崔成姬，张洪宝，金 迪

(1. 长春中医药大学附属医院，长春 130021； 2. 长春中医药大学，长春 130117)

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)为病理学诊断名称，临床表现为发作性肉眼血尿伴持续性镜下血尿，可伴有蛋白尿、高血压、肾功能损害。IgA肾病是国内最常见的原发性肾小球疾病，发病率占原发性肾小球病的58.2%[1-2],且逐年升高。IgA肾病患者中15%～40%在确诊后10～20年逐渐进展至终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)[3]，需要透析或肾移植。目前西医治疗本病，糖皮质激素和免疫抑制剂的有效性及安全性仍存在争议，故不能被广泛应用；对于单纯以血尿为主，尿中无蛋白或24 h尿蛋白定量<1 g的IgA肾病只能动态观察，且这部分患者20年后仍可发展为ESRD。应用ACEI或ARB虽然可以在一定程度上减轻蛋白尿，但在IgA肾病的治疗中疗效欠佳[4-5]。

益肾止血颗粒是长春中医药大学附属医院肾病科主任张守琳的经验方，功效为滋阴补肾、健脾利湿、活血化瘀。自1996年应用其治疗IgA肾病20余年，可有效减轻患者血尿、蛋白尿及临床症状[6]。因此，本实验拟采用经典的IgA肾病大鼠模型，考察该方对IgA肾病的疗效及可能的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

选择SPF级雄性SD大鼠共90只，6～8周龄，体质量(180±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0006，实验动物编号20180059。常规饲养于长春中医药大学SPF级动物房，大鼠普通饮食，自由饮水(由实验室提供)，室温(22±2)℃，相对湿度(55±5)%，自然昼夜节律光照。本实验经长春中医药大学伦理委员会批准。

1.2 药物及制备

肾炎康复片(国药准字Z10940034)，天津同仁堂集团股份有限公司。益肾止血颗粒组成：黄芪、枸杞子、女贞子、地黄、墨旱莲、大蓟、小蓟、大黄、栀子、白茅根、槐花、益母草、牡丹皮、赤芍、当归等，批号20180510，由长春中医药大学中医药研究中心提供。

1.3 主要仪器及试剂

正置研究级显微镜(Olympus，型号BX53)；组织破碎机(上海般诺生物科技有限公司，型号BIO-950)；分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司，型号721G)；全自动生化分析仪(东莞市健威医疗器械有限公司，型号BS-380)；荧光素标记兔抗鼠IgA抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-10491R，规格100ul)；全自动尿沉渣分析仪(Sysmex，型号UF-1000i)；IL-1、IL-6、IL-10、MMP-9、TIMP-1酶联免疫吸附测定试剂盒(美国R&D公司，批号分别是RRA00、R6000B、R1000、RMP900、RTM100)；牛血清白蛋白、脂多糖、蓖麻油(美国sigma公司，批号分别为A1933、SMB00610、259853)；四氯化碳(北京化学试剂厂，批号C112040)。

2 方法

2.1 分组及造模

对90只SD大鼠采用分层随机的方法分为空白组、模型组、益肾止血颗粒高剂量组、益肾止血颗粒中剂量组、益肾止血颗粒低剂量组、肾炎康复片组(对照组)每组各15只。参照陆慧渝[7]等方法制作IgA肾病大鼠模型，给予BSA配成100 g/L浓度的稀释液体，以4 ml/kg灌胃隔日1次，共持续8周；将CCl4与蓖麻油以1∶3的比例混合均匀，0.4 ml/只皮下注射，每周1次，共持续8周；将LPS配成0.25 g/L的溶液，于第6周每只尾静脉注射0.2 ml。于造模结束后每组大鼠各选择3只，取肾脏行免疫荧光检查验证模型。

2.2 给药

于第9周开始给药：对照组给予肾炎康复片0.648 g·kg-1·d灌胃，空白组、模型组给予生理盐水2 ml·kg-1·d灌胃，益肾止血颗粒组应用益肾止血颗粒分别灌胃，即低剂量组1.406 g·kg-1·d，中剂量组2.813 g·kg-1·d，高剂量组5.625 g·kg-1·d，每组大鼠给予相应药物灌胃，每日1次，连续8周，于第16周末取材。

2.3 取材与指标检测

2.3.1 大鼠一般情况 观察各组大鼠毛色、光泽度、活动次数、精神状态、食欲、大便、体质量及尿颜色改变等。

2.3.2 各时相尿红细胞计数、24 h尿蛋白定量检测 分别将大鼠放入大鼠代谢笼中,收集24 h尿液(此期间禁食不禁水)，采用尿沉渣计数法检测尿红细胞个数，采用磺基柳酸法检测24 h尿蛋白定量。

2.3.3 肾功能与血清细胞因子水平检测 实验结束时，用1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠，从腹主动脉采血并分离血清备检。应用全自动生化分析仪检测血清BUN、SCr的含量，采用酶联免疫法检测血清IL-1、IL-6及IL-10 含量。

2.3.4 肾组织MMP-9、TIMP-1含量检测 取肾脏后清理血液及筋膜，将肾脏纵行剖开切取皮质部组织，用研磨机研磨均浆，浆液采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测肾组织中MMP-9、TIMP-1含量，打印检测结果分组统计。

2.3.5 肾组织IgA免疫荧光检测 剪取双侧肾脏称重，左侧固定做病理用，直接法染色。新鲜组织冰冻切片(8 μm)、干燥、冷丙酮固定40 min,PBS液洗后滴加荧光素标记的兔抗大鼠IgA抗体,温度37 ℃烘箱中孵育40 min,PBS液洗后用缓冲液甘油封片,正置研究级显微镜(Olympus)荧光模式下观察。以镜下无荧光显示为(-)，极弱黄绿色荧光显示为(±),有黄绿色荧光显示为(+)，较强的黄绿色荧光显示为(++),强、略刺眼的黄绿色颗粒状荧光显示为(+++)，强、略刺眼的黄绿色团块状荧光为(++++)。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 益肾止血颗粒对IgA肾病大鼠一般情况的影响

造模过程中共死亡7只大鼠，造模后每组选取3只大鼠用于验证模型是否成功。空白组大鼠状态始终良好，体质量逐渐增加。造模组大鼠4周后出现食欲减退，毛色晦暗，活动减少，体质量减轻，尿色变深，8周症状加重。给药后肾炎康复片组及益肾止血颗粒组大鼠食欲、活动明显好转，体质量增加。

表1显示，与空白组比较，模型组大鼠体质量减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。自第10周起与模型组比较，各治疗组大鼠体质量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.2 益肾止血颗粒对IgA肾病大鼠血尿、蛋白尿的影响

表2显示，与空白组比较，模型组大鼠10周、12周、16周尿红细胞、24 h尿蛋白定量增多(P<0.05)；与模型组比较，肾炎康复片组与益肾止血颗粒组从10周起(即给药2周)尿红细胞、24 h尿蛋白定量均明显减少，随给药时间延长，尿红细胞、24 h尿蛋白定量减少更为明显(P<0.05)，其中益肾止血颗粒中剂量组效果最好。

3.3 益肾止血颗粒对IgA肾病大鼠血清肾功及细胞因子的影响

表3示，与空白组比较，模型组大鼠血SCr、BUN、IL-1、IL-6、IL-10升高(P<0.05)；与模型组比较，肾炎康复片组及益肾止血颗粒组大鼠血SCr、BUN、IL-1、IL-6、IL-10下降(P<0.05)。

3.4 益肾止血颗粒对IgA肾病大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的影响

表4示，与空白组比较，模型组肾组织中MMP-9含量明显下降，TIMP-1含量明显升高，MMP-9/TIMP-1下降(P<0.05)；与模型组比较，肾炎康复片组及益肾止血颗粒组MMP-9升高，TIMP-1降低，MMP-9/TIMP-1上调(P<0.05)。

注：空白组(×400)模型组(×400)模型组(×400)图1 造模后大鼠空白组及模型组肾脏病理免疫荧光比较

3.5 益肾止血颗粒对IgA肾病大鼠肾脏病理免疫荧光的影响

空白组肾皮质内肾小球未见IgA免疫荧光染色，与空白组比较，模型组肾小球内可见大量荧光信号，荧光较强且呈不连续颗粒状沉积(见图1)。按国际共识对IgA肾病的诊断标准，表明动物模型复制成功。

表5显示，正常组大鼠肾系膜区无IgA沉积，模型组肾小球系膜区有较强的团块状黄绿色强IgA荧光或颗粒状中等强度IgA荧光。益肾止血颗粒高、中、低剂量组及肾炎康复片组大鼠肾小球系膜区显示为散在的线状或颗粒状轻度IgA荧光或中等强度IgA荧光，较模型组明显减弱。

表5 各组大鼠给药后肾小球IgA免疫荧光半定量评分(频数)

4 讨论

IgA肾病为免疫病理诊断，其特点为肾小球系膜增生，用免疫荧光法检查见肾小球系膜区有IgA沉积。血尿、蛋白尿为IgA肾病最常见的临床表现，常表现为发作性肉眼血尿伴持续性镜下血尿，可伴有轻度蛋白尿或大量蛋白尿。现代研究认为，在IgA肾病发病过程中,多种原因共同作用[8-10]，尤其是细胞外基质的过度沉积，导致免疫应答异常、肾小球硬化和肾间质纤维化，从而引发肾衰竭或加重发展。

细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)积聚过多是引起IgA肾病进展的机制之一。ECM的生成和降解维持动态的平衡，在这个过程中,基质蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)可降解ECM，金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)可抑制MMPs，其中MMP-9能降解ECM胶原和非胶原成分，同时TIMP-1可抑制MMP-9，从而影响ECM的积聚。大量实验证明，IgA肾病的发生发展与基质金属蛋白酶-9异常相关，通常与尿蛋白呈正相关, 与血肌酐呈负相关[11]。因此，MMP-9/ TIMP-1失衡是导致ECM降解异常的重要环节。研究表明，通过调节肾脏组织MMP-9/TIMP-1，可改善肾纤维化的病变程度，延缓IgA肾病进展[12-14]。同时，白介素作为具有生物活性的炎性因子，与IgA肾病密切相关，可激活并调节免疫细胞，引起免疫应答异常及免疫炎症反应，并可促进系膜基质增多从而引发IgA肾病。

本课题组基于中医理论提出IgA肾病本虚标实、脾肾亏虚是其本，湿热瘀阻是其标。益肾止血颗粒功效为滋阴补肾、健脾利湿、活血化瘀，是根据多年临床经验研制而成，可显著降低IgA肾病血尿、蛋白尿。益肾止血颗粒方中君药为黄芪、枸杞子，黄芪补益中气，升阳固表，利水消肿；枸杞子补肝肾、益精血，两药合用既能补肾健脾、滋养肾精，同时又能利尿祛湿。现代药理研究认为，黄芪能促进受损伤肾组织修复而具有降低蛋白尿、保护肾功能的作用。热聚膀胱、热伤血络发为尿血，耗伤肾阴，故以女贞子、生地黄、旱莲草助君药补肾养阴以培其本，二蓟清热止血散瘀以治其标，共为臣药。大黄泻火解毒，栀子清热利湿，配合槐花凉血止血，则热清而血自止；白茅根清热、凉血、止血、利尿；益母草活血调经，利水消肿；牡丹皮、赤芍清热凉血散瘀，使止血而不留瘀；当归和血可防诸药寒凉太过，上8味共为佐使药，诸药合用有滋阴补肾、健脾利湿、活血化瘀之效。

本实验显示，与空白组比较，模型组大鼠UTP、尿RBC及血清SCr、BUN明显升高；与模型组比较，经治疗后益肾止血颗粒各组及肾炎康复片组大鼠UTP、尿RBC、SCr、BUN均降低，说明益肾止血颗粒能明显减轻IgA肾病模型大鼠尿红细胞及尿蛋白，保护肾功能。同时与空白组比较，模型组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10明显增高，肾组织MMP-9降低，TIMP-1升高，MMP-9/TIMP-1呈失衡状态；与模型组比较，经治疗后益肾止血颗粒各组及肾炎康复片组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10下降；肾组织MMP-9升高，TIMP-1降低，MMP-9/TIMP-1比例升高，MMP-9/ TIMP-1失衡纠正，揭示了益肾止血颗粒可能通过调节IL-1、IL-6、IL-10水平及MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1，从而通过调节免疫反应及改善ECM的过度积聚起到治疗作用。