心阳片通过抑制NLRP3炎性小体保护慢性心力衰竭肾脏炎性损伤的作用及机制研究❋

王俊岩，王陵军，梁碧容，张 璐，冼绍祥，汪朝晖

(1. 广州中医药大学第一临床学院， 广州 510405； 2. 广州中医药大学第一附属医院， 广州 510405； 3. 广州中医药大学岭南医学研究中心， 广州 510405； 4. 广东省普通高校慢性心力衰竭中医药防治重点实验室，广州 510405； 5. 广州市慢性心力衰竭中医药防治重点实验室，广州 510405)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是常见的心血管疾病终末期阶段，具有高发病率、高死亡率的特点，严重威胁人类的生命健康和生存质量。由于CHF心脏搏出量不足，导致全身血液灌注不足以及回流受阻，进一步导致组织器官缺血缺氧以及水钠潴留，最终合并多种并发症[1]。其中心肾综合征是常见的并发症之一，属于中医学“心水”“水肿”等范畴。认为心阳不足无以温肾，肾水不能上蒸无以荣心，心肾不交而加重本病的进展[2-3]。对于慢性心力衰竭的治疗临床多采用益气温阳活血利水治法进行防治，课题组长期从事心力衰竭及其并发症防治工作，形成了一系列中医药防治心力衰竭的治法及方药。心阳片是益气温阳活血利水的代表药物，前期研究证实其能有效改善心功能、水钠潴留等[4-5]。NOD样受体蛋白3 (nOD-like receptor protein 3, NLRP3)是NLRs家族中的一员，与凋亡相关点样蛋白(apoptosisassociated Speck-like Protein Cotaining, ASC)以及caspase1等形成炎症复合体，介导多种炎症反应性疾病[6]。本研究从NLRP3炎症小体介导的炎症反应为切入点，观察益气温阳活血利水中药心阳片对慢性心力衰竭小鼠肾功能保护作用及可能的机制。

1 材料

1.1 动物

60只C57BL/6 J小鼠，体质量(25±3) g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2018-0034。所有动物饲养于广州中医药大学SPF级实验动物中心，自由摄食与饮水。本实验已通过广州中医药大学实验动物伦理委员会审查(20190226030)。

1.2 药物、试剂与仪器

心阳片(批号20180401)及培哚普利叔丁胺片(雅施达)由广州中医药大学第一附属医院药学部提供，由红参、黄芪、益母草、毛冬青等组成。血肌酐、尿素氮检测试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；TNF-α、IL-6 Elisa试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；NF-κB p65 antibody、NLRP3 antibody、caspase1 antibody、IL1β antibody购自武汉赛维尔生物技术有限公司。二甲苯、无水乙醇购自天津大茂化学试剂厂；免疫组化试剂盒、抗原修复液、DAB显示液、苏木素染色液、盐酸乙醇均购自福州迈新生物技术开发有限公司。小动物超声(Vevo，2100)；PCR仪(Applied Biosystems，QuantStudio 3)；组织切片机(lecia)；酶标仪(Tecan，M200 pro)；显微镜(Nikon，DS-Ri2)。

2 方法

2.1 分组、造模及干预

60只小鼠随机分为假手术组、模型组、中药低、中、高剂量组、阳性对照组。采取主动脉缩窄(TAC)术构建压力负荷型慢性心力衰竭模型，小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，并在连接到呼吸机时进行开胸手术，使用27G针和8-0 缝线将主动脉结扎在右无名动脉和左颈总动脉之间，使腹主动脉截面积缩窄至原来的25%～30%左右，造成腹主动脉缩窄，关闭胸腔。假手术组仅开胸、穿线不结扎。按照人与小鼠体表面积换算给药等效剂量，给予相应剂量灌服。中药低剂量组给予等效剂量治疗，即0.34 g/kg，中药中剂量组给予2倍等效剂量治疗，即0.68 g/kg，中药高剂量给予4倍等效剂量治疗，即1.36 g/kg，阳性对照组给予培哚普利等效剂量治疗，即0.607 mg/kg，假手术组合模型组给予等量生理盐水灌胃。给药8周后，小动物超声检测心功能，分离小鼠血清及肾脏组织分别固定于4%多聚甲醛中和-80 ℃冰箱中待测。

2.2 心功能测定

采用小动物超声检测小鼠心功能水平。小鼠异氟烷麻醉后，脱毛膏将颈部至胸部皮毛脱掉后涂抹耦合剂后采用相应探头进行超声观察，并计算小鼠射血分数(EF)、收缩分数(FS)值。

2.3 血清肾功能生化指标检测

采用深圳迈瑞BS-380全自动生化分析仪检测小鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平。将血清肌酐和尿素氮试剂加入仪器试剂区，取出冻存的血清，室温融化后放入样本区，设置仪器进行检测。

2.4 ELISA法检测各组小鼠血清TNF-α和IL-6水平

采用酶联免疫法检测各组小鼠血清TNF-α和IL-6水平变化，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.5 肾脏组织Masson染色

将4%多聚甲醛固定的肾脏组织进行石蜡包埋后切片，染色前将石蜡切片脱蜡至水，苏木素染细胞核5 min后自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗反蓝，丽春红染色5 min，蒸馏水快速漂洗，磷钼酸水溶液处理约3 min，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸处理1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片，显微镜下观察并拍照分析。

2.6 免疫荧光法检测肾脏NLRP3表达水平

将-80 ℃冻存的心脏组织进行OTC包埋后行冰冻切片，染色前将冰冻切片进行复温，在组织周围用免疫组化笔画圈防止液体流走，山羊血清封闭30 min，室温下一抗孵育1 h，PBS中洗3次，每次5 min；避光条件下室温孵育荧光二抗30 min，PBS中洗3次，每次5 min；DAPI染色液室温避光孵育10 min，PBS中洗3次，每次5 min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下观察细胞内NLRP3及DAPI表达情况并采集图像。

2.7 免疫组化法检测相关蛋白水平

采用免疫组化法检测小鼠肾脏NF-κB p65、NLRP3、caspase1、IL1β蛋白表达情况。将4%多聚甲醛固定24 h后的肾脏组织进行石蜡包埋，行6 μm厚度切片，烘片后进行脱蜡复水后进行免疫组化染色，将脱蜡复水的切片进行抗原热修复，3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，BSA封闭，4 ℃一抗(1∶100稀释)孵育过夜，次日PBS中洗3次，每次3 min；室温下二抗孵育1 h，PBS中洗3次，每次3 min，除去PBS，切片上滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min，除去PBS，切片上滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，PBS反蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，普通光学显微镜下观察并拍照。

2.8 RT-PCR法检测肾脏组织相关mRNA水平表达

表1示，取30 mg肾脏组织，采用离心柱法提取总RNA，操作严格按照试剂盒说明书进行，测定浓度后将所有样本总RNA浓度稀释为200ng/μL后反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR法加入扩增反应体系，40个循环后采用△△CT法进行相对定量分析，检测相关基因mRNA相对表达水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列表

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 各组小鼠EF、FS变化情况

小动物超声结果显示，造模及治疗8周后，与假手术组比较，模型组小鼠心脏EF、FS水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性治疗组治疗后，小鼠心脏EF、FS水平明显升高(P<0.01)，且各剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组小鼠超声心动图结果

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：## P<0.01图2 各组小鼠EF、FS变化比较

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：## P<0.01图3 各组小鼠血清Cr、BUN水平变化比较

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：## P<0.01图4 各组小鼠血清Cr、BUN水平变化比较

3.2 各组小鼠血清Cr、BUN水平变化情况

肾功能检测结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠 SCr、BUN水平显著升高；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性对照组治疗后，小鼠血清SCr、BUN水平显著降低(P<0.01)，且各剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.3 各组小鼠血清TNF-α和IL-6水平变化比较

ELISA法检测结果显示，与假手术组比较， 模型组小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性对照组治疗后，小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.01)，且各剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.4 各组小鼠肾脏纤维化情况

Masson染色结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠肾脏有较多蓝色胶原纤维沉积；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性对照组蓝色胶原纤维沉积明显减少。

3.5 各组小鼠肾脏组织NLRP3蛋白表达变化比较

免疫荧光结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠肾脏NLRP3荧光表达水平明显升高；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性对照组小鼠肾脏NLRP3荧光表达水平明显降低。

3.6 各组小鼠肾脏NF-κB p65、NLRP3、caspase1、IL1β蛋白表达变化比较

免疫组化结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠肾脏NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明显升高;与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性对照组小鼠肾脏NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明显降低。

3.7 各组小鼠肾脏组织炎症相关mRNA表达变化比较

RT-PCR结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠肾脏NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明显升高;与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阳性对照组小鼠肾脏NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明显降低。

4 讨论

近年来，随着心血管介入技术等不断发展，急性心肌梗死等急性心血管不良事件得到有效救治，是导致慢性心力衰竭发病率逐渐升高的原因之一。慢性心力衰竭的发生主要是由于各种因素导致心脏射血功能不足，心脏输出量不能满足身体正常活动需要，在运动或劳累时明显加重，严重影响患者的生存质量，并具有高死亡率的特点[7]。心力衰竭时伴有肾素-血管紧张素-醛固酮 (RAAS) 系统过度激活，将导致肾脏血流灌注不足合并肾脏损伤，心肾同时出现功能不全亦称为“心肾综合征”[8]。根据其临床症状其属于中医学“心悸”“水肿”“喘证”“怔忡”等范畴，认为本病为本虚标实之证，病位在心，累及肺、脾、肾、脑等全身脏腑组织器官，临床多采用益气温阳活血利水的方法进行治疗，在改善慢性心力衰竭症状的同时，亦能有效改善由于血液供应不足导致的水肿、气喘等多脏腑症状[9]。中医学认为，心肾两脏之间的关系主要表现为水与火的关系，心在五行属火，位居于上而属阳，肾在五行属水，位居于下而属阴[10]，心与肾无论是在脏腑经络联系上还是功能相互作用，均有着密切关系。在经络联系上心肾二经均为少阴经所属，在功能上肾主一身之元阴元阳，心为生之本，二者相互滋生，共同维持身体的阴阳平衡[11]。益气温阳活血利水中药心阳片为我院院内制剂，被广泛应用于临床，心阳片由红参、黄芪、益母草、毛冬青、熟附子等组成，具有益气温阳、活血通络、利水平喘功效，主要应用于气阳亏虚挟痰瘀型心力衰竭，研究证明能有效改善心衰症状，改善血流动力学，延缓心衰进程[12-14]。因此，本研究以“水火相济”理论为基础，观察慢性心力衰竭对肾脏功能及炎性反应的影响以及益气温阳活血利水法的干预，并探讨其可能机制。

注：图中箭头所指的蓝色位置为胶原蛋白沉积图5 各组小鼠肾脏Masson染色结果比较(20×)

注：图中箭头所指的位置为NLRP3蛋白表达阳性图6 各组小鼠肾脏NLRP3蛋白表达水平比较(20×)

注：图中箭头所指的位置为蛋白表达阳性图7 各组小鼠肾脏NF-κB p65、NLRP3、caspase1、IL1β蛋白表达水平比较(20×)

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：## P<0.01图8 各组小鼠肾脏炎症相关指标mRNA表达水平比较

研究表明，肾脏组织的炎性反应是肾脏疾病的主要病理反应和诱因，因此防治肾脏炎性反应在防治肾脏损伤及纤维化中具有重要意义[15]。NLRP3与ASC及caspase1形成的炎症复合体是炎性反应中研究最多的炎症小体，即NLRP3炎症小体，它能够诱导IL1β、IL 1β、IL 18、IL 6等炎症因子释放而引起炎症反应。研究证实，NLRP3炎症小体信号激活主要通过NF-κB信号启动IL1β和NLRP3前体蛋白表达，并在活化的caspase1作用下促进下游炎症因子成熟分泌，进一步导致炎症损伤[16]。有研究表明，NLRP3炎性小体活化能够加快肾脏损伤进程[17]。研究发现，慢性心力衰竭时NF-κB表达明显升高，且参与心室重构、炎症反应等重要病理过程[18-19]。因此，本课题组提出慢性心力衰竭是否通过引起NF-κB表达升高激活肾脏NLRP3炎性反应信号通路，进而导致肾脏损伤的假说，且益气温阳活血利水法改善心功能的同时是否能够通过调控NF-κB/NLRP3信号通路改善肾脏炎性损伤。

肾脏Masson染色发现，CHF小鼠肾脏胶原蛋白沉积明显增多，表明CHF小鼠肾脏已经发生纤维化改变。经心阳片治疗后，CHF小鼠心功能明显改善的同时肾脏纤维化水平亦明显减低，表明心阳片在改善心功能的同时能够抑制肾脏纤维化。肾脏组织免疫荧光及免疫组化染色观察相关蛋白水平显示，CHF小鼠肾脏NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明显升高，经心阳片治疗后各组小鼠肾脏NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明显降低。RT-PCR结果显示，CHF小鼠肾脏NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明显升高。与模型组比较，经心阳片后各组小鼠肾脏NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明显降低。结果表明，益气温阳活血利水中药心阳片在改善CHF小鼠心功能的同时，能够改善肾脏炎性反应并抑制纤维化，其机制可能是通过调控NF-κB/NLRP3信号通路、抑制炎性反应实现的。课题组亦进一步采用多种动物模型和细胞水平进行验证，并进行多角度多靶点探讨，深入阐明慢性心力衰竭对肾功能的影响，构建“水火相济”理论内涵网络。