基于“病证结合”构建与评价一种新的抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型❋

童 萍，李玉芳，李睿博，刘 晶，卜 平△，孔桂美

(1. 扬州大学临床医学院，江苏 扬州 225001； 2. 扬州大学医学院，江苏 扬州 225001； 3. 大连医科大学，辽宁 大连 116044)

抑郁症(major depressive disorder，MDD)因其较高的发病率、致残率、自杀率和较低的治愈率，影响着全球3亿多人的健康[1-2]。抑郁症是一种高度异质性的疾病，由于缺乏确切的现象学标准和神经生物学基础[3]，使诊疗过程复杂，或常因缺乏个体差异性导致治疗效果不佳[4-5]。中医学在诊疗过程中强调“辨证论治”，同样的疾病可表现不同的证型。流行病学调查发现，抑郁症肝郁脾虚证最为常见[6]。然而至今，基于“病证结合”的抑郁症肝郁脾虚证动物模型的建立及外周血液特征性指标的探索，国内外鲜有报道。本研究采用西医病因病理复制疾病的动物模型，联合中医病因病机复制证候的模型，建立抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型，并初步研究血浆GABA代谢的变化，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

ICR成年雄性小鼠30只，购自扬州大学比较医学中心，体质量25～29 g，动物生产许可证号SCXK(苏)2017-0007。于扬州大学中西医结合系实验动物房适应性饲养1周(适应过程中死亡1只)。动物房环境温度20～26 ℃，湿度40%～60%。1周后完成体质量、旷场实验、蔗糖偏好实验、悬尾实验和强迫游泳实验以及粪便性状的基线水平测量，随后将小鼠分为对照组14只和实验组15只。为避免造模过程中小鼠之间的相互啮咬，每笼只饲养1只小鼠。本实验已通过扬州大学实验动物伦理委员会审查(SYXK(苏)2017-0044)。

1.2 药物

10%水合氯醛、1%(w/v)的蔗糖溶液、生大黄粉。

1.3 试剂及仪器

小鼠γ氨基丁酸(GABA)、谷氨酸脱羧酶65(GAD65)和谷氨酸脱羧酶67(GAD67)抗体检测试剂盒(购自上海酶联生物科技有限公司)，Rayto RT-6100酶标仪、电子计数称、秒表、计时器、悬挂支架，动物行为视频分析系统，1 ml注射器，9号灌胃针头。

1.4 造模方法

CUMS(Chronic unpredictable mild stress)[7-8]是经典的构建抑郁症动物模型的方法，是指以持续温和不可预知的刺激诱导动物出现和抑郁症患者类似的行为表现；大黄灌胃[9-11]法是以大黄模拟苦寒败胃、肝郁日久、木郁乘土、肝郁脾虚的病理演变过程来构建肝郁脾虚证方法。利用病证结合的原则，复合运用CUMS和大黄灌胃进行造模。

相关研究表明，影响数控机床热变形误差的主要原因是主轴部件热变形误差，由于实验条件有限，并且这篇论文主要是验证LWT-LSSVM建模预测方法的可行性与准确性，所以只对数控机床部分发热部件进行实验分析和研究。

1.4.1 抑郁症的造模方法 参照CUMS模型，对实验组施行断水断食24 h，夹尾1 min，10 ℃冰水游泳5 min，水平摇晃1次/s，持续 5 min，灯光刺激24 h，湿垫料24 h，倾斜鼠笼45°，持续24 h。每天随机选择1 种刺激，每种刺激平均使用4次，连续刺激28 d。

1.4.2 肝郁脾虚证的造模方法 于实验组行CUMS造模第15天开始，同时对实验组给予15%大黄粉悬液0.5 ml灌胃(分3次，早0.2 ml，中0.15 ml，晚0.15 ml)，连续 14 d，于CUMS造模28 d结束。

1.5 观察指标及方法

造模前和造模后完成2组小鼠的体质量测量、行为实验和粪便收集，造模结束后采集小鼠血浆。为避免顺序对观察指标的影响，实验组与对照组交叉进行。

1.5.1 抑郁症的观察 旷场实验(open field test,OFT)、蔗糖偏好实验(sucrosepreference test,SPT)、悬尾实验(tail suspension test,TST)和强迫游泳实验(forced swimming test,FWT)是常用的评价实验动物抑郁症模型的指标。本实验以旷场实验中的活跃度和平均速度、蔗糖偏好指数(蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+纯水消耗量)×100%)、悬尾和强迫游泳不动时间来评估模型小鼠的抑郁程度。

表1 Bristol粪便量表

1.5.3 血浆GABA浓度的检测 造模结束后，以ELISA法测定小鼠血浆GABA、GAD65和GAD67浓度。10%水合氯醛腹腔注射(0.04 ml/10 g)，小鼠麻醉后摘眼球取血3 ml，置于EDTA抗凝管中混合15 min后离心20 min(3000 r/min)，收集上清分装于1.5 ml离心管，-80℃冰箱冻存待检,检测过程按试剂盒步骤进行。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 造模对小鼠行为的影响

2.1.1 造模前后2组小鼠行为指标差异 表2示，对造模前后2组小鼠的旷场实验、蔗糖偏好实验、悬尾实验和强迫游泳实验结果分别进行独立样本t检验和配对样本t检验。

结果显示，造模使小鼠的平均速度和活跃度降低(P<0.01)，小鼠活动受限，蔗糖偏好指数下降(P<0.01)，快感缺失，悬尾实验中不动时间延长(P<0.05)，强迫游泳时放弃挣扎时间延长(P<0.01)，呈现绝望样抑郁状态。

2.1.2 实验组小鼠行为指标相关性分析 表3示，对实验组小鼠的行为指标进行Pearson相关分析，反应活跃程度的指标如平均速度、活跃度，与反应快感的指标如蔗糖偏好指数之间呈显著正相关(P<0.01)；反应绝望程度的指标如强迫游泳不动时间、悬尾不动时间之间呈显著正相关(P<0.05)；反应活跃程度的指标与反映绝望程度的指标之间呈显著负相关(P<0.01)。结果显示，造模致实验组小鼠的抑郁样行为相关性高，结果稳定一致。

表3 实验小鼠各行为指标的相关性比较

2.2 造模对小鼠体质量和粪便的影响

表4示，对2组小鼠体质量和粪便BSFS得分分别进行独立样本t检验和配对样本t检验。造模降低小鼠体质量增加的幅度(P<0.05)，使小鼠粪便含水量增加(P<0.01)，出现大便溏薄及类似肝郁脾虚证的表现。

表4 2组小鼠造模前后体质量和粪便性状比较

2.3 造模对小鼠血浆GABA代谢的影响 表5示，对2组小鼠造模后血浆GABA、GAD65和GAD67浓度进行独立样本t检验。结果显示， 造模致小鼠血浆GABA、GAD65和GAD67浓度显著下降(P<0.01)。

表5 2组小鼠造模后血浆GABA、GAD65及GAD67比较

3 讨论

抑郁症的症状异质性大，其差异性直接影响治疗的结局[4]。诊疗的个体化及独特症状的识别与预后有关[14-15]。中医的“辨证论治”和“整体观”强调诊治的个体差异，是通过综合体征、症状与脉象、舌象等多方面信息进行辨别诊治的过程。不同证型的疾病，需要根据个体差异进行有针对性的治疗[16]。

动物模型是研究抑郁症发病机制的重要手段[17]。目前，有关抑郁症不同中医证型的动物模型大都借用抑郁症造模方法，往往通过观察总结中医证型[18]或根据中药治疗效果反推可能的证型[19]，但存在滞后性和缺乏特异性，影响研究结果的临床转化[20]。

血液特征性指标异常的发现对于快速诊断疾病意义重大。研究发现，GABA能系统地与抑郁症的发病高度相关[21-23]，且可通过调整GABA及其受体功能调整肝脾的消化功能[24-25]。GABA在体内是由兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu)经谷氨酸脱羧酶(GAD)脱羧而来，GAD 包含2种同工酶GAD65和 GAD67[26]。研究发现，GABA能系统功能与肝郁脾虚证密切相关[27-28]。

基于此，本研究运用“病证结合”理论原则，在CUMS的基础上联合大黄灌胃，构建抑郁症肝郁脾虚证的小鼠模型。模型小鼠表现活动速度减慢、活跃度下降、蔗糖偏好指数降低、悬尾不动时间和强迫游泳不动时间延长等典型的抑郁症状；同时，模型小鼠出现纳差、体质量增长缓慢、大便稀溏的肝郁脾虚症状，说明模型小鼠具备抑郁症肝郁脾虚证的症状学表现[29-30]。本研究以血浆GABA、GAD65和GAD67浓度为指标，探索抑郁症肝郁脾虚证小鼠的外周GABA代谢情况，以期为抑郁症肝郁脾虚证寻找特征性病理指标，结果提示“病证结合”造模方式削弱了模型小鼠GABA的代谢。

“病证结合”动物模型在中医药现代化研究中具有明显优势[31]。该模型可克服西医辨病与中医辨证局限，使诊疗过程更加具有个体差异，使临床医疗行为更加精准[32]。本研究结果显示，“病证结合”构建的抑郁症肝郁脾虚证小鼠具备成功模拟抑郁症病与肝郁脾虚证的临床表型，符合其精神紧张、忧郁恼怒, 致肝气郁结、肝失疏泄、横逆犯脾，或思虑伤脾、土虚木乘、脾失健运、气机升降失常[36]的病机，可作为抑郁症肝郁脾虚证的病机、治疗的进一步研究，血浆GABA代谢指标可作为佐证指标。当然，样本量和小鼠性别的选择是本研究的不足之处，新模型仍需扩大样本量，挖掘并验证更多客观指标。本课题组将会继续探究其机制与稳定性，促进中医证候模型的深入研究，不断挖掘病证结合动物模型在中医药现代化研究中的价值和应用。