商品化农残速测试剂盒对5种农药的敏感性测定

罗俊霞，赵建波，张刚，杨华，张启成，王清

1. 郑州市农产品质量检测流通中心（郑州 450006）；2. 郑州市农业技术推广中心（郑州 450006）；3. 河南恒晟检测技术有限公司（郑州 451100）

随着社会的发展和人们生活水平的提高，食品安全问题越来越引起人们的关注，也受到各级政府部门的重视。在农业生产中，农药的使用有助于降低作物病虫草害，提高作物的产量，但过量使用则会引起农产品质量安全问题[1-3]。我国农药的生产量和使用量在全世界排名第一[4]，生产中有机磷和氨基甲酸酯类农药由于其价格低、杀虫谱广等优点在农业生产中被广泛使用，20世纪80年代至21世纪初期，其使用量最多时占到农药总产量的70%以上[4]，其残留超标问题远高于其他类农药等问题[5-6]。因此，加强农药残留的检测力度，对农产品的安全进行风险监测与评估刻不容缓。现有的农药残留检测方法有色谱法、色谱-质谱联用法、光谱法[7-9]、生物传感器法[10-11]等，这些方法定量定性较为准确，但是耗时费力，对检测人员要求较高。目前公认的较为快速的检测方法是酶抑制法，这种方法在农产品质量安全检测监管工作一线被广泛应用于样品的初筛，但是这种方法也存在种种弊端，如不能定量也不能定性[12]、同一种酶对不同的农药敏感性不一样[13-16]、不同的酶对同一种农药的敏感性也不同[17]。为了了解商品化的酶抑制-比色法快速检测农药残留的试剂盒对氨基甲酸酯类农药的敏感性，特安排此次试验，希望对使用者在购买商品化的酶抑制-比色法农残速测试剂盒时起到一定的指导作用，从而更好地服务于农产品质量安全的监管工作。

1 试验部分

1.1 试验仪器与试剂

CL-BIII型16通道的农残速测仪（上海博纳新技术研究所、上海复博农业科技有限公司）；SHA-C型双重恒温水浴振荡器（杰瑞尔电器有限公司）；HH.W21-Cr 420型电热恒温水浴锅（北京三二八科学仪器有限公司）；WH-861型漩涡混合器；Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液枪；农药残留检测试剂盒的品牌分别是深圳市A试剂盒、广州B试剂盒、广东C试剂盒、厦门D试剂盒、湖北E试剂盒、深圳F试剂盒。

由农业环境保护科研检测所生产的质量浓度为1 000 mg·L-1的涕灭威、涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、克百威等氨基甲酸酯类农药标准品，使用时按照需要稀释成80 μg·mL-1的储备液。

1.2 试剂配制

各品牌的农药残留检测试剂盒里有缓冲试剂、酶试剂、显色剂和底物，在每次使用前，缓冲试剂用500 mL的蒸馏水溶解，酶试剂、显色剂和底物分别按照各试剂盒说明书的要求进行配制；具体见表1。

1.3 试验设计

此次试验为三因素试验，分别为试剂盒品牌、农药种类、样品提取液的取用量；对1.1小节中第一个因素，每一种农药分别设置5个浓度梯度，按照样品称样2 g，模拟加入农药后样品的实际浓度为0.05，0.5，1，2和3 mg/kg，每一个浓度设置3次重复；根据缓冲溶液或者样品提取液的取用体积，针对每一种农药的每一个浓度设置两个处理，为取用3 mL提取液或者2.5 mL提取液。

1.4 对照液的测试

分别移取3 mL或者2.5 mL缓冲溶液于10 mL试管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的显色剂，用旋涡混合振荡器混匀，再用电热恒温水浴锅在37 ℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物摇匀，立即放入仪器比色池中，用CL-BIII型16通道的农残速测仪测定3 min内的吸光度变化值，分别设定为3 mL或者2.5 mL的取用体积条件下的ΔA的值。

表1 几个品牌酶抑制法速测试剂盒中各种试剂的配制方法表

1.5 样品处理

样品处理参照GB/T 5009.199—2003[18]进行。将1.3小节中制备的模拟样品（5个浓度梯度的农药）中加入10 mL缓冲液，用双重恒温水浴振荡器振荡提取10 min，然后分别移取3 mL或者2.5 mL的样品提取液于10 mL试管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液（B按照说明书加酶20 μL）、0.1 mL的显色剂，用旋涡混合振荡器混匀，再用电热恒温水浴锅在37 ℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物摇匀（B、D按照说明书要求加底物20 μL），立即放入仪器比色池中，用CL-BIII型16通道的农残速测仪测定3 min内的吸光度变化值，通过仪器读出其抑制率。

1.6 试验数据的处理

1) 根据每一个处理的3次测定值计算出变异系数，考察每一种试剂盒在检测过程中的精密度或者测试样品的重现性。

2) 参照文献[19-28]的方法，对各品牌试剂盒测定各种农药的3次测定结果，选取抑制率在100%以下的浓度，对抑制率和农药浓度常用对数进行线性拟合，求出抑制率方程和相关系数，根据抑制率方程计算各种试剂盒测定各农药的半抑制浓度IC50。IC50的计算根据抑制率方程的Y=50%也就是抑制率为50%时，计算出相对应的X轴的值，由此计算出相对应的浓度。

3) 各品种试剂盒对各种农药的灵敏度的测定。试验设定抑制率为10%时为各种农药的最低检测限，根据抑制率方程计算出当抑制率为10%时各种农药相对应的浓度，为其最低检测限，记为IC10。

4) 通过（1）～（3）的结果比较，3 mL和2.5 mL的样品提取体积对测定结果的影响。

5) 通过（3）和（4）的结果比较，同一种商品化的试剂盒对5种不同的氨基甲酸酯类农药的敏感性。

2 结果与分析

2.1 各品牌试剂盒测定样品的重现性

由表2可知，各品牌的试剂盒测定农药的重现性在所使用的玻璃器皿清洗较好且检测结果非异常的情况下都比较好；一般来讲，对于同一种试剂盒测定同一种农药，抑制率越高，其相对标准偏差越小。

2.2 几种试剂盒测定5种氨基甲酸酯类农药时抑制率和农药浓度的相关性及检出限、敏感性的分析和比较

2.2.1 几种试剂盒测定涕灭威时抑制率和农药浓度的相关性及检出限、敏感性的分析和比较

由表3可知，6种试剂盒测定涕灭威时抑制率与农药浓度的对数之间均存在良好的线性关系，无论是3 mL的样品取用量还是2.5 mL的样品取用量，其相关系数均在0.827 3～0.998 7之间。就IC10看，当样品取用量为3 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照E、D、B、F、A、C的顺序降低；当样品取用量为2.5 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照A、E、F、B、D、C的顺序降低。在3 mL的样品取用量和2.5 mL的样品取用量之间，A试剂盒、D试剂盒存在较大差异，呈现倍数关系，F试剂盒存在的差异最小。

2.2.2 几种试剂盒测定涕灭威亚砜时抑制率和农药浓度的相关性及检出限、敏感性的分析和比较

由表3可知，6种试剂盒测定涕灭威亚砜时抑制率与农药浓度的对数之间均存在良好的线性关系，无论是3 mL的样品取用量还是2.5 mL的样品取用量，其相关系数均在0.897 6～0.976 5之间。就IC10看，当样品取用量为3 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照E、F、B、A、D、C的顺序降低；当样品取用量为2.5 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照E、F、B、D、C的顺序降低。由于各试剂盒对涕灭威亚砜均极敏感，因此在3 mL的样品取用量和2.5 mL的样品取用量之间，各试剂盒均存在较明显差异，但于实际的检测工作没有意义。

表2 各品牌试剂盒测定几种农药的相对标准偏差对照表

表3 各种试剂盒对4种农药的抑制率方程及最低检测限对照表

2.2.3 几种试剂盒测定涕灭威砜时抑制率和农药浓度的相关性及检出限、敏感性的分析和比较

由表3可知，6种试剂盒测定涕灭威砜时抑制率与农药浓度的对数之间均存在良好的线性关系，无论是3 mL的样品取用量还是2.5 mL的样品取用量，其相关系数均在0.852 6～0.999 6之间。就IC10看，当样品取用量为3 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照E、D、C、F、B、A的顺序降低；当样品取用量为2.5 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照E、D 、F、B、C的顺序降低。在3 mL的样品取用量和2.5 mL的样品取用量之间，各试剂盒稍有差异。

2.2.4 几种试剂盒测定灭多威时抑制率和农药浓度的相关性及检出限、敏感性的分析和比较

由表3可知，6种试剂盒测定灭多威时抑制率与农药浓度的对数之间均存在良好的线性关系，无论是3mL的样品取用量还是2.5 mL的样品取用量，其相关系数均在0.881 9～0.992 2之间。就IC10看，当样品取用量为3 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照D、F、B、A 、C、E的顺序降低；当样品取用量为2.5 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照F、B、D、C、E的顺序降低。在3 mL的样品取用量和2.5 mL的样品取用量之间，各试剂盒稍有差异。

2.2.5 几种试剂盒测定克百威时抑制率和农药浓度的相关性及检出限、敏感性的分析和比较

由表3可知，6种试剂盒测定克百威时抑制率与农药浓度的对数之间均存在良好的线性关系，无论是3mL的样品取用量还是2.5 mL的样品取用量，其相关系数均在0.723 7～0.999 4之间。就IC10看，当样品取用量为3 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照F、B、D、E、C、A的顺序降低；当样品取用量为2.5 mL时，试剂盒对涕灭威的敏感性按照F、B、D、E、C的顺序降低。在3 mL的样品取用量和2.5 mL的样品取用量之间，B、D、F试剂盒存在较大差异，但于检测工作没有意义。

2.3 同一种试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性比较

由表3可知，就IC10来看，当样品提取液的取用量为3 mL时，A试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性按照涕灭威亚砜、灭多威、涕灭威、涕灭威砜、克百威的顺序降低；无论样品提取液的取用量为3 mL还是2.5 mL，B试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性按照克百威、涕灭威亚砜、灭多威、涕灭威、涕灭威砜的顺序降低；无论样品提取液的取用量为3 mL还是2.5mL，C试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性按照涕灭威亚砜、克百威、灭多威、涕灭威砜、涕灭威的顺序降低；当样品取用量为3 mL时，D试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性按照克百威、涕灭威亚砜、灭多威、涕灭威、涕灭威砜的顺序降低，当样品取用量为2.5 mL时，D试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性按照克百威、涕灭威亚砜、灭多威、涕灭威砜、涕灭威的顺序降低；无论样品提取液的取用量为3 mL还是2.5 mL，E试剂对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性按照涕灭威亚砜、克百威、涕灭威砜、涕灭威、灭多威的顺序降低；无论样品提取液的取用量为3 mL还是2.5 mL，F试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药的敏感性按照涕灭威亚砜、克百威、灭多威、涕灭威、涕灭威砜的顺序降低。

3 讨论

GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限》[29]中规定食品中涕灭威的最小残留限量为0.02 mg/kg，灭多威的最小残留限量为0.05 mg/kg，克百威的最小残留限量为0.02 mg/kg，而涕灭威亚砜和涕灭威砜是涕灭威的代谢产物，其毒性比涕灭威的毒性更高[30]；就IC10来看，部分试剂盒能满足GB 2763对克百威的限量要求，多数试剂盒能满足GB 2763对灭多威的要求，多数试剂盒不能满足GB 2763对涕灭威的要求；而在蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法NY/T 448[31]和蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测GB/T 5009.199—2003[18]中分别规定超标样品抑制率为70%和50%，而裘正军等[32]认为抑制率在40%～70%之间，为可疑农残超标样品，需复查确定，抑制率大于70%，农药残留浓度较高，可判定为农药残留超标样品。但是由于酶抑制-比色法快速检测农药残留的方法既不能定量也不能定性[12]，就氨基甲酸酯类农药的测定而言，C试剂盒测定涕灭威时，抑制率达到50%时农药的浓度为3.786 2和3.864 6 mg/kg，A试剂盒测定克百威时，抑制率达到50%时农药的浓度为8.055 6 mg/kg，显然大大高于GB 2763对克百威的限量要求，将抑制率40%～70%的样品视为可疑样品时，如果样品中含有此类农药，显然漏掉了可疑样品，因此认为当抑制率为10%时，可判定该样品为可疑农残超标样品，需使用色谱、质谱进行定性定量。

4 结论

利用各种试剂盒对5种氨基甲酸酯类农药进行5个浓度水平的测定，用所测定的抑制率和农药浓度的对数进行线性拟合，相关系数在均在0.723 7～0.999 4之间，说明各试剂盒的抑制率和氨基甲酸酯类农药浓度的对数之间存在良好的线性关系；但是每种试剂盒对各种农药的敏感性均不相同，不同的试剂盒对相同的农药敏感性也不一样。6种试剂盒均对涕灭威亚砜表现极为敏感，B、F、D试剂盒对克百威也较为敏感。