HMGB-1抑制剂甘草酸对急性心肌梗死大鼠炎性损伤及JAK/STAT、Wnt3a通路的影响

鲁雪丽 张韩 姚新亮 郭晶晶 鲁艳娇 李彦明

(河南大学淮河医院心血管内科，河南 开封 475000)

急性心肌梗死(AMI)属于临床常见心血管疾病，发病率、病死率逐年升高，严重危害人类身体健康〔1〕。心肌梗死发病机制较复杂，涉及多方面如环境、遗传、氧化应激、炎症损伤等。酪氨酸激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)在心血管疾病发生机制中起着重要的调控作用，基础研究认为JAK/STAT通路抑制后可引发心肌组织损伤，进而参与心肌梗死、心力衰竭等心脏相关疾病的发生、发展〔2〕。Wnt/β-catenin信号通路与心血管疾病的发生密切相关，研究发现Wnt/β-catenin信号通路异常激活与心肌缺血、冠心病、心脏衰竭等疾病密切相关〔3,4〕。甘草酸是从植物甘草中分离的主要化学成分，具有较好的抗炎作用，且副作用较少，近期研究发现甘草酸可作为高迁移率族蛋白(HMGB)-1抑制剂，对脑损伤、脑缺血等血管疾病具有较好的抗炎作用〔5〕，然而甘草酸在心肌梗死中的作用目前尚不明确，本研究通过建立心肌梗死模型大鼠，并给予甘草酸干预，旨在探究其对心肌梗死大鼠心肌组织的保护作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 70只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，8周龄，体重180～200 g，由郑州大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为：SCXK(豫)2018-0001，动物使用许可证号为：SYXK(豫)2018-0005，动物质量合格证号为：0050472，统一环境下饲养，严格遵循动物饲养守则，1 w后用于模型制备。

1.2主要试剂与仪器 卡托普利购自上海施贵宝制药有限公司，批号：20181227；HMGB-1抑制剂甘草酸购自浙江金华康恩贝生物制药有限公司，批号：20190115；TRIzol试剂购自美国Sigma-Aldrich公司，批号：T9424；蛋白浓度检测试剂盒、氯化三苯基四氮唑(TTC)染液购自美国Solarbio公司，批号：PC0030、G3005；兔抗鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、HMGB-1单克隆一抗购自英国Abcam公司，批号：ab6604、ab5014、ab0037、ab1029、ab77302；兔抗鼠Wnt3a、β-catenin、β-actin一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG二抗购自美国R&D公司，批号：ST00648、ST5072、ST11354、ST2053；肿瘤坏死因子(TNF)-α、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒均购自上海沪震实业有限公司，批号：0011c、0253c；RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所，批号：P0013A；Vevo 770型小动物超声成像系统购自加拿大visualsonics公司；DYCZ-25E型电泳仪器购自北京六一仪器厂；ChemiDocTM凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；BX43型倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司

1.3动物模型建立 根据文献〔6〕建立心肌梗死模型大鼠。随机选取60只大鼠进行模型建立，经腹注射戊巴比妥钠(1%，40 mg/kg)充分麻醉大鼠，仰卧于手术操作台上，气管插管连接呼吸机，于沿左侧第三肋间制作3 cm手术切口，逐步分离皮下组织，行左胸廓切开术，采取6-0无菌丝线在离左冠状动脉前降支根部1 mm部位进行结扎，当心电图显示ST段呈现弓形向上型抬高，证实心肌梗死模型建立成功。结扎后还纳心脏，缝合切口，恢复自主呼吸后拔除呼吸机，每天使用10万U青霉素抗感染，连续3 d。共50只大鼠造模成功，其余10只因操作不当、感染等原因死亡。假手术组(n=10)仅穿线，不进行冠状动脉结扎。

1.4动物给药与分组 造模成功后，将模型大鼠分为模型组、甘草酸低、中、高剂量组、卡托普利组，每组10只。甘草酸低、中、高剂量组：造模成功后，灌胃10、20、40 mg/kg甘草酸(将甘草酸用生理盐水配置成浓度分别为1、2、4 mg/ml的溶液，灌胃体积为10 ml/kg)，每天1次，连续给药4 w〔7〕；卡托普利组：造模成功后，灌胃6.25 mg/kg卡托普利(将卡托普利用生理盐水配置成浓度分别为0.625 mg/ml的溶液，灌胃体积为10 ml/kg)，每天1次，连续给药4 w〔8〕；假手术组、模型组均灌胃10 ml/kg的生理盐水，每天1次，连续4 w。

1.5观察指标与检测方法

1.5.1超声检测大鼠心室功能变化情况 末次给药结束后麻醉大鼠，在二维超声模式下，对各组左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室射血分数(LVEF)进行测定，计算左心室短轴缩短率(FS)，至少测定3个心脏周期，获取平均值。

1.5.2样本收集 超声测定结束后，每组选取4只大鼠处死，迅速获取心肌组织，用于TTC染色；各组剩余6只大鼠处死后，收集血液，3 000 r/min离心10 min后，置于-20℃中冻存，获取心肌组织，部分置于4%多聚甲醛固定，另一部分在-20℃冻存。

1.5.3TTC染色观察大鼠心肌组织梗死情况 将获取的心肌组织用PBS溶液清洗后，将左心室沿冠状方向切为5片，用1% TTC染液在37℃中染色20 min，随后置于4%多聚甲醛中固定24 h，染白部分为梗死区域，用Image-J软件定量分析梗死面积比，梗死面积百分比=染白区域面积/总面积×100%。

1.5.4苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织形态学变化情况 取出固定的心肌组织，经脱腊、脱水、包埋后制备心肌组织石蜡切片，参考HE染色试剂盒对组织切片进行染色，在显微镜下观察心肌组织病理变化情况。

1.5.5ELISA检测血清中TNF-α、MCP-1水平 参照ELISA试剂盒说明书对各组大鼠血清中TNF-α、MCP-1水平进行检测。

1.5.6Western印迹法检测心肌组织中JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表达情况 取冻存梗死区域组织，用RIPA裂解液提取组织总蛋白，对蛋白浓度检测后，用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭后，采取HMGB-1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt3a、β-catenin、β-actin的一抗抗体孵育膜，4℃冰箱中过夜，用HRP标记二抗室温下孵育膜2 h，经化学发光法显影，以β-actin为内参，使用Image-J图像分析软件对条带进行扫描，蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.6统计学处理 采用SPSS21.0软件进行方差分析，SNK-q检验。

2 结 果

2.1甘草酸对心肌梗死大鼠心室功能的影响 与假手术组相比，模型组LVEDD、LVESD明显升高，LVEF、FS明显降低(均P<0.05)。与模型组相比，甘草酸各剂量组、卡托普利组LVEDD、LVESD明显降低，LVEF、FS明显升高(均P<0.05)；随着甘草酸剂量的增加，甘草酸各剂量组LVEDD、LVESD逐渐降低，LVEF、FS逐渐升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。甘草酸高剂量组与卡托普利组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠心室功能有关指标比较

2.2甘草酸对心肌梗死大鼠心肌梗死面积的影响 与假手术组〔(3.47±0.38)%,n=4〕相比，模型组心肌梗死面积比例明显升高〔(39.93±4.41)%，P<0.05〕。与模型组相比，甘草酸低、中、高剂量组、卡托普利组心肌梗死面积比例明显降低〔(32.52±4.33)%、(26.28±3.47)%、(20.18±3.46)%、(19.04±3.35)%，均n=4，P<0.05〕；随着甘草酸剂量的增加，甘草酸各剂量组心肌梗死面积比逐渐降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。甘草酸高剂量组与卡托普利组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

2.3甘草酸对心肌梗死大鼠组织形态学的改善 HE染色显示，假手术组心肌组织结构正常，细胞及肌原纤维均排列有序。模型组心肌细胞发生大量变性、坏死，肌原纤维断裂，部分排列紊乱，组织伴有炎性细胞浸润。甘草酸各剂量组及卡托普利组破裂、坏死心肌细胞数量有所减少，肌原纤维断裂减少，心肌损伤程度得到一定的缓解。见图2。

2.4甘草酸对心肌梗死大鼠TNF-α和MCP-1水平 与假手术组相比，模型组TNF-α和MCP-1水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，甘草酸各剂量组、卡托普利组TNF-α和MCP-1水平明显降低(均P<0.05)；随着甘草酸剂量的增加，甘草酸各剂量组TNF-α和MCP-1水平逐渐降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。甘草酸高剂量组与卡托普利组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

A：假手术组，B：模型组，C：甘草酸低剂量组，D：甘草酸中剂量组，E：甘草酸高剂量组，F：卡托普利组，图3同图1 TTC染色观察大鼠心肌梗死面积比例变化情况

图2 HE染色观察心肌梗死大鼠心肌组织形态学变化情况(200×)

表2 各组血清中TNF-α、MCP-1水平比较

2.5甘草酸对心肌梗死大鼠JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表达的影响 与假手术组相比，模型组心肌组织中p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白水平明显降低，HMGB-1、Wnt3a、β-catenin 蛋白表达明显升高(均P<0.05)。与模型组相比，甘草酸各剂量组、卡托普利组p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白水平明显升高，HMGB-1、Wnt3a、β-catenin 蛋白表达明显降低(均P<0.05)；随着甘草酸剂量的增加，甘草酸各剂量组p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白水平逐渐升高，HMGB-1、Wnt3a、β-catenin 蛋白表达逐渐降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。甘草酸高剂量组与卡托普利组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图3。

表3 各组心肌组织中JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表达比较

图3 Western印迹法检测心肌组织中JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表达

3 讨 论

本研究提示心肌梗死大鼠心肌细胞受损，组织出现炎症损伤。心肌缺血发生后引发的炎症反应进一步引发心肌细胞凋亡，造成左心室重构和心衰〔9〕。本研究表明心肌梗死大鼠心肌舒缩功能受损，推测心肌梗死大鼠心肌细胞坏死，引起心肌炎症损伤，引发心功能失调，提示心肌梗死大鼠模型建立成功。

甘草酸别名甘草甜酸，属于甘草中重要的活性物质之一，具有抗病毒、抗免疫、抗炎的生物活性。近期研究发现甘草酸也可作为HMGB-1的抑制剂，通过抑制HMGB-1活性进而发挥炎症反应，Shafik等〔10〕研究发现甘草酸可通过抑制HMGB-1活性改善关节炎炎症反应。Yan等〔11〕研究发现脑缺血再灌注损伤大鼠中经甘草酸处理后能够明显缩小梗死体积，改善神经功能损伤，其可能是通过抑制MGB1介导的TLR4/NF-κB信号通路实现的。本研究结合文献推测甘草酸可能通过抑制HMGB-1活性来抑制心肌梗死大鼠心肌炎症损伤，发挥对心肌组织的保护作用。

炎症反应一直存在于心肌缺血的整个过程，早期炎症反应标志为血清中炎症因子及趋化因子水平显著升高，进而引起强烈的炎症反应，加重心肌缺血性损伤。MCP-1属于常见趋化因子，可通过招募心肌组织炎性细胞至炎症部位，引发炎症反应〔12〕。TNF-α属于重要的炎症因子，在心肌梗死心肌组织中高表达，可造成心肌细胞凋亡、心肌肥大及心室重构〔13〕。本研究推测甘草酸可能通过降低心肌梗死大鼠炎症相关因子表达，缓解心肌组织炎症损伤，发挥对心肌梗死大鼠心肌损伤的保护作用。

JAK/STAT信号通路在细胞增殖、凋亡、分化、炎症反应中起着重要的调控作用。JAK/STAT家族中包含多个成员，而JAK2、STAT3与心肌损伤关系最为密切。Abdelsamia等〔14〕研究发现采用JAK抑制剂预处理心肌缺血损伤模型大鼠后，心肌组织中JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平，进而缓解心肌炎症反应，发挥对心肌组织的保护。李红霞等〔15〕发现心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中JAK2/STAT3通路蛋白表达明显降低，而经丹参酮ⅡA处理后，心肌组织中JAK2/STAT3通路蛋白表达明显升高，心肌炎症损伤得到缓解。本研究结果推测甘草酸可能通过激活JAK/STAT信号通缓解心肌炎症损伤。

Wnt/β-catenin信号通路与心脏的发育有关，参与心血管相关疾病的发生〔16,17〕。过往研究显示在心脏发育早期，Wnt/β-catenin信号通路活化对心肌细胞的分化具有促进作用；而在成人心肌组织中，正常生理状态下，Wnt/β-catenin信号通路处于关闭状态，而在心肌缺血、心力衰竭、冠心病等心脏疾病组织中Wnt/β-catenin信号通路处于异常激活状态〔18〕。Li等〔19〕研究发现miR-34a通过Wnt/β-catenin信号通路调节大鼠心肌梗死后细胞凋亡。Qiu等〔20〕研究发现黄芩苷通过抑制Wnt3a/β-catenin信号通路减轻H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤。本研究结果推测甘草酸可能通过抑制Wnt3a/β-catenin信号通路缓解心肌炎症损伤。