痰样分离的高黏液型肺炎克雷伯菌耐药性及毒力基因检测

胡久丽 肖旭 朱孝芹 辛春兰 胡潺潺 李国芸

(承德医学院附属医院 1临床药学部，承德 067000；2肿瘤科；3科研处)

老年呼吸系统感染的主要病原菌为革兰阴性菌，最为常见的是铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌〔1〕。其中高黏液型肺炎克雷伯菌具有高侵袭性，由于老年人免疫功能衰退，容易形成反复感染，是临床颇为棘手的一大难题〔2〕。目前，临床上治疗肺炎克雷伯菌的主要是碳青霉烯类抗菌药物，但近年碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的检出率越来越高〔3，4〕。2015～2016年度卫生部全国细菌耐药监测网(Mohnarin)的检测数据显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和比阿培南的耐药率分别为14.6%、14.4%及15.8%〔5〕，如何克服肺炎克雷伯菌的耐药性成为亟待解决的一大难题。本研究分析135株自老年呼吸道感染患者痰样中分离出的高黏液型肺炎克雷伯菌，对毒力基因和其耐药进行总结。

1 材料与方法

1.1菌株来源 135株高黏液型肺炎克雷伯菌来源于承德医学院附属医院2017年1月至2018年12月送检的痰液样本。纳入标准：① 患者>60岁；②出现呼吸道感染症状；③ 黏液丝试验检测结果为高黏液表型；④患者自愿签署知情同意书。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853 和肺炎克雷伯ATCC700603均购于卫生部临床检验中心。

1.2主要试剂与仪器 Luria-Bertani培养基(赛默飞世尔)；DNA抽提试剂盒(碧云天)；DNA Marker DL 2000(宝生物)；PCR扩增试剂盒(赛默飞世尔)；琼脂糖(宝生物)；核糖核酸酶(宝生物)；紫外分光光度计(日立)；自动微生物鉴定/药敏分析系统(贝克曼库尔特)；低温冷冻离心机(贝克曼库尔特)；凝胶成像分析系统(日立)；PCR仪(赛默飞世尔)；水平电泳仪(六一仪器)等。

1.3超广谱β-内酰胺酶活性(ESBLs)和耐药性检测方法 ESBLs活性和耐药性实验参照中华人民共和国卫生部推荐的“纸片扩散法及操作标准”〔6〕进行判定，测定阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星等15种抗菌药物的耐药性。

1.4毒力基因检测方法 采用PCR实验测定肺炎克雷伯菌的7种荚膜血清型和11种毒力基因。主要步骤：(1)所得菌种，接种至Luria-Bertani培养基，37℃、5%CO2条件下培养12 h；借助显微镜，用接种镊子挑取单菌，再次培养12 h，获得活化的肺炎克雷伯菌，更换培养基继续培养至对数期。(2)采用DNA抽提试剂盒提取肺炎克雷伯菌的DNA，提取过程和纯化过程均按照试剂盒说明书操作；所得DNA最终溶解于TE缓冲液(1 mmol/L Tris-HCl+0.5 mmol/L EDTA，PH 8.0，现用现配)。(3)紫外可见光分光光度计下侧定DNA的浓度和纯度，以OD260/OD280=1.8～2.0为合格标准，纳入PCR。(4)在无菌工作台和PCR板上操作，根据PCR扩增试剂盒说明书要求配置30 μl PCR体系，其中7种荚膜血清型(wzyK1、wzyK2、wzyK3、wzxK5、wzyK20、wzxK54、wzyK57)的引物及扩增条件参照Zhang等〔7〕报道结果，12种毒力基因(magA、ureA、aerobactin、iroN、mrkD、fimH、wcaG、entB、p-rmpA、p-rmpA2、alls、iutA)的引物及扩增条件参照Guo等〔8〕报道结果进行操作。(5)本研究所需引物均委托上海生工合成，所得产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察实验结果。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0软件行χ2检验。

2 结 果

2.1ESBLs活性和耐药性检测结果 本次检测的135株高黏液型肺炎克雷伯菌共检出ESBLs阳性菌36株(26.7%)，ESBLs阴性菌99株(73.3%)。ESBLs阳性菌对5种头孢菌素、左氧氟沙星、妥布霉素、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率明显高于ESBLs阴性菌(P<0.05)，其中对头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南及阿莫西林/克拉维酸的耐药性高达100%；无论是ESBLs阳性菌还是ESBLs阴性菌，其主要敏感抗菌药物为亚胺培南和美罗培南，耐药率分别为1.5%和4.4%，对妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星的耐药率在20%以内，也可以作为临床治疗的可选药物。见表1。

表1 135株高黏液型肺炎克雷伯菌的耐药性〔n(%)〕

2.2荚膜血清型基因测定结果 135株高黏液型肺炎克雷伯菌共检出wzyK2型40株(29.6%)，wzyK1型20株(14.8%)，wzyK57型15株(11.1%)，wzxK54型11株(8.1%)。ESBLs阳性菌与ESBLs阴性菌之间各个荚膜血清型未无明显差异(P>0.05)。见表2。

2.3毒力基因测定结果 135株高黏液型肺炎克雷伯菌，毒力基因的检出率偏高，其中aerobactin和mrkD的检出率最高，分别为82.2%和89.6%，iroN、fimH、wcaG、p-rmpA的检出率也在70%以上。其中ESBLs阳性菌aerobactin、iroN、wcaG的检出率均明显低于ESBLs阴性菌(P<0.05)；其他类型的毒力基因无明显差异(P>0.05)，见表3。

表2 135株高黏液型肺炎克雷伯菌的荚膜血清型分布〔n(%)〕

表3 135株高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力基因分布〔n(%)〕

3 讨 论

研究表明〔9〕，肺炎克雷伯菌耐药机制较多，ESBLs和碳青霉烯酶是目前已发现的主要耐药酶，前者可抵抗头孢菌素和单环β-内酰胺类抗菌药物，后者可抵抗几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物。结果与其他学者的报道〔10，11〕结果基本一致，均支持ESBLs阳性菌耐药性增强这一结论。然而，临床用药的实际情况与药敏实验稍有出入，这主要是因为药敏实验测试的对象是游离细菌，而很难反映出生物膜的作用及细菌在人体内环境中与免疫系统的相互作用，这解释了为什么毒力基因是近年广受关注的热点。

目前，国际上关于毒力基因并没有权威定义。一般认为，荚膜多糖是肺炎克雷伯菌最重要的毒力因子，可包裹菌体，抵抗宿主免疫细胞和药物作用。根据荚膜多糖血清分型，可将肺炎克雷伯菌分为至少78个血清型，其中与高黏液型相关的主要有K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57等〔12〕。本研究结果与国内学者近几年报道的流行病学趋势大体一致〔13，14〕，均认为wzyK1、wzyK2、wzxK54、wzyK57型菌株的毒力和流行趋势颇为严峻，需重点控制。另外，本研究与国内学者余倩等〔15〕报道结果稍有出入，余倩等〔15〕发现携带高毒力因子wzyK1/wzyK2/wzyK57的多为ESBLs阴性菌。这可能是由于不同样本来源的肺炎克雷伯菌荚膜血清分型分布趋势不一致所致，余倩等〔15〕应用的是血液样本，而本研究应用的是痰样样本。因此，本研究认为在分析高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力基因时，对不同来源的样本做比对分析也较为重要，利于为临床用药提供更准确的参考信息。

除了荚膜多糖以外，其他能够提高肺炎克雷伯菌侵袭能力的基因，如利于生物膜形成、促进铁离子转运或菌毛形成的基因也被作为肺炎克雷伯菌的毒力基因，本研究晒选了临床报道较多的12个毒力基因进行测试，结果与魏丹丹等〔16〕报道的尿液分离的高黏液型肺炎克雷伯菌检测结果基本一致。p-rmpA和p-rmpA2均属于黏液调控因子的一种，既往研究证实，高毒力的肺炎克雷伯菌可通过促进p-rmpA 和p-rmpA2表达提高荚膜的形成能力。汪强等〔17〕对肝脓肿分离的高毒力肺炎克雷伯菌的分析结果显示p-rmpA和wcaG是医院分离的主要毒力基因型。wcaG是将甘露糖转化为岩藻糖，进而产生超级荚膜的必须基因，敲除wcaG的肺炎克雷伯菌同时也失去了形成荚膜的能力〔18〕。fimH与mrkD具有编码细菌菌毛的功能，aerobactin和iroN可促进铁载体产生和铁离子转运，这4种毒力基因在在肺炎克雷伯菌中也普遍存在〔19〕。既往也有学者指出〔20〕，ESBLs阴性菌某些毒力基因的携带率可能更高，因此高毒力基因的耐药率也可能较低，与本研究结论一致。

综上，老年呼吸道感染患者痰样分离的高黏液型肺炎克雷伯菌耐药性受ESBLs表达的影响，ESBLs阳性菌株的耐药性虽然普遍偏高，但某些高毒力荚膜血清分型和毒力基因的携带率可能偏低，临床用药方面应兼顾耐药分析和毒力基因分布规律。