NLRP3基因多态性与慢性阻塞性肺疾病的相关性

贾钦尧 陈绍平 宋珊 韩美玲 李新胜

(川北医学院 1药学院，四川 南充 637000；2附属医院呼吸内科；3武汉市肺科医院；4安康市人民医院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是临床常见的以持续性气流受限为主要特征的慢性炎症性疾病，患者存在不同程度的进行性肺功能降低及异常的对气体和有毒颗粒的炎症反应，具有较高的发病率〔1〕。COPD的影响因素众多，包括天气、吸烟、感染、物理因素、化学因素等，其与机体免疫系统互相作用会诱发气道慢性持续炎症，导致气道不完全阻塞和狭窄，支气管软骨受到破坏，肺组织弹性降低等，最终导致通气功能下降。慢性气道炎症反应被认为在COPD发生发展中发挥着核心作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3是参与炎症反应的重要蛋白，研究已经发现COPD患者中NLRP3表达异常，其可能在COPD发生发展中发挥重要作用〔2〕。王蕾等〔3〕研究发现NLRP3的表达与COPD疾病的严重程度密切相关。基因多态性是指存在两种或多种不连续的变异型、基因型或等位基因，NLRP3基因的多态性与多种炎性疾病有关，包括类风湿关节炎、阿司匹林诱发哮喘等，但目前有关NLRP3基因与COPD之间的关系还未见研究报道〔4，5〕。本研究分析了4个近年来NLRP3基因和疾病相关研究的热点区域，包括rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419，应用TaqMan探针检测法检测这4个位点的单核苷酸多态性，分析NLRP3基因的多态性与COPD的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选择2017年10月至2018年10月在川北医学院附属医院确诊的COPD患者共200例作为研究组，年龄52～73岁，平均(64.78±4.03)岁，选择同期健康者60例作为对照组，年龄55～74岁，平均(65.28±3.99)岁，两组的一般资料差异无统计学意义。本研究已经获得伦理委员会批准。

1.2纳入和排除标准 纳入标准：(1)年龄18～75岁；(2)符合COPD的诊断标准〔1〕；(3)资料完整；(4)签署知情同意书。排除标准：(1)合并肺结核、哮喘、支气管扩张等疾病；(2)合并其他部位感染；(3)合并恶性肿瘤。

1.3研究指标 患者在门诊接受问卷调查，收集患者一般资料，其中吸烟定义为每日吸烟量>10支，吸烟时间>10年；饮酒定义为饮酒量为4个标准杯(56°白酒100 ml)，每周饮酒超过5次，饮酒时间超过5年。抽取患者外周静脉血共10 ml，通过PCR-RFLP 技术检测NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4个位点的单核苷酸多态性。使用酚-氯仿法从外周血淋巴细胞中提取所有参与者的基因组DNA。通过NanoDrop-2000c(Thermo Scientific，USA)检测提取的DNA的浓度。使用0.2 μl光学96孔反应板(ABI 7300，Biosystems，USA)进行NLRP3(rs10754558，rs3806265，rs4612666和rs35829419)基因分型。每个微孔中的总体积为20 μl，由10 μl的MasterMix(ABI 7300，Biosystems，USA)，0.5 μl AssayMix(ABI)，4.5 μl去离子水和5 μl DNA样品(20 ng/ml)组成。制备含有1 000 MasterMix(2×)，50 μl AssayMix(4×)和450 μl去离子水的混合物，将15 μl混合物和5 μl DNA样品加入每个微孔中。 PCR条件如下：95℃、10 min，40个循环，95℃、15 s，60℃、1 min，使用等位基因辨别程序确定结果。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验、F检验、χ2检验、Logistic回归分析、Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结 果

2.1两组基本资料比较 研究组吸烟比例显著高于对照组(P<0.05)，其他指标无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.2两组NLRP3基因多态性分布比较 研究组NLRP3基因rs3806265位点的等位基因T的频率显著高于对照组(P<0.001)，研究组NLRP3基因rs3806265位点TT的基因型显著高于对照组(P<0.001)，CT基因型显著低于对照组(P<0.001)，其他点位基因多态性无显著差异，见表2。

表1 两组基本资料比较

表2 两组NLRP3基因多态性分布比较〔n(%)〕

2.3COPD危险因素 Logistic 回归分析 Logistic 回归分析结果显示吸烟〔OR=3.056,95%CI(1.956～6.757);P=0.011〕和rs3806265位点TT基因型〔OR=2.341,95%CI(1.194～4.689);P=0.023〕是COPD的危险因素(P<0.05)。

3 讨 论

COPD在临床上常表现为咳嗽咳痰、气喘、呼吸困难，COPD患者若得不到有效的救治会诱发严重炎症反应及肺的纤维化，甚至导致呼吸衰竭，严重危害患者的生命健康。我国是COPD高发国家，COPD在40岁以上人群发病率高达8.2%，并且随着空气环境污染等原因，COPD的发病率有上升趋势〔6〕。但是目前关于COPD的发病机制尚不明确，基因多态性可能是引起COPD的因素之一。

NLRP3是NLRPs蛋白家族中的典型成员，组成包括C-端亮氨酸重复序列、N-端PYD结构域和中间的NACHT结构域。经C-端亮氨酸重复序列，NLRP3可识别三磷酸腺苷(ATP)、胞壁酰二肽(MDP)、内毒素、尿酸、细胞裂解产物等配体，使其被激活并进一步导致其构象发生变化，通过其PYD结构域这一效应结构域其可募集带有天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)募集结构域(CARD)的Caspase-1和凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)，形成NLRP3炎性体这一复杂的复合物。研究发现，NLRP3参与脓毒症等炎性疾病的发生和发展密切相关〔7〕。NLRP3可激活Caspase-1，激活的Caspase-1会进一步激活白细胞介素(IL)-1β和IL-18，导致促炎反应，氧化应激反应、炎性因子会激活NLRP3，最终引起各种免疫炎症反应〔8〕。目前，NLRP3在慢性炎症反应、无菌性炎症反应和自身免疫性疾病等病理过程中的意义和作用备受关注，很多感染性疾病和自身免疫性疾病都涉及到NLRP3炎性体-Caspase-1-IL18/IL-1β轴的激活。

NLRP3基因的多态性参与多种炎性疾病的发生，研究发现rs10754558 隐性模型是哈萨克族老年原发性高血压高危因素〔9〕。李赛等〔10〕研究认为山东汉族人群NLRP3基因rs2027432位点多态性与子痫前期的发生有关。国外也有研究显示NLRP3基因rs4612666多态性与大动脉粥样硬化性缺血性脑卒中和微栓子信号的发生有关〔11〕。Zhou等〔12〕研究认为NLRP3 rs10754558多态性与中国汉族人群冠状动脉病变的发生及预后相关。已经有研究证实NLRP3参与COPD的发生和COPD急性加重期的发生〔13〕，但是关于NLRP3基因多态性与COPD的研究极少。为了进一步探讨NLRP3基因多态性与COPD的关系，本次研究共分析了NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4个对中国汉族人群重要的单核苷酸多态性(SNPs)位点的单核苷酸多态性，其中rs10754558被指出与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染易感性有关，rs3806265被认为与葡萄膜炎的发病有关，rs4612666和rs35829419则被指出与骨髓增生异常综合征、痛风等的易感性有关。Yu等〔14〕研究发现NLRP3基因rs3806265位点的多态性与银屑病的发生有关。Bidoki等〔15〕的研究也发现复发性口疮性口炎患者NLRP3 rs3806265 TT基因型的高频率与其易感性有关。本研究提示rs3806265位点TT基因型是可能COPD的危险因素。这一结果证实，rs3806265 SNP位点的遗传多态性可能会增加COPD的风险，TT基因型是COPD发病的危险因素。过往已经有研究显示吸烟是引起COPD的危险因素〔16〕。研究显示吸烟是激活NLRP3炎性小体的因素之一〔17〕。Han等〔18〕研究显示香烟烟雾提取物通过增加泛素介导的蛋白酶体加工调节NLRP3蛋白丰度，这提示吸烟与NLRP3和COPD的发生有关，因此，推测分析NLRP3基因的多态性可能是连接吸烟和COPD的中间环节。