槲皮素改善慢性心力衰竭模型大鼠心功能的作用机制

张福宸 刘婧 贾伟佳 张丽敏 李大鹏 张桂霞

(佳木斯市中心医院心内科，黑龙江 佳木斯 154002)

慢性心力衰竭是一种由心脏结构和(或)功能异常引起的导致心输出量减少的临床综合征〔1〕。目前认为，慢性心力衰竭的主要原因包括心肌本身性疾病和心脏负荷过重性疾病，前者包括冠状动脉硬化性心脏病、心肌梗死、心肌炎、扩张型心肌病等，后者包括高血压、心脏瓣膜狭窄和关闭不全、慢性贫血和甲状腺功能亢进等〔2，3〕。慢性心力衰竭在老年人群中的发病率较高，它会导致多器官受累和受损，常伴有呼吸困难、疲乏、液体潴留(如肺瘀血、体循环瘀血及外周水肿)和活动耐量下降等临床表现〔4〕。心肌损伤、心脏结构发生不可逆性重塑、心脏舒缩功能异常及血流动力学紊乱是促使该病发展的推动因素〔5〕。近年来随着医疗方法和手段的不断更新，人类在心力衰竭治疗中取得了长足的进步，但患者的主要健康转归，如住院率和健康相关生活质量等并没有得到明显的改善。根据最新的研究结果表明，23%～58%的慢性心力衰竭患者在1年后的随访中将会再次入院〔6〕。

槲皮素是一种来自于植物的黄酮类化合提取物，其分布广泛，在高良姜、侧柏叶、三七、桑寄生和款冬花等100多种药用植物中均可被检测到。作为一种重要的抗氧化制剂和免疫调节天然化合物，槲皮素具有预防和治疗包括骨质疏松、癌症、肺部和心血管等多种疾病的作用〔7〕。研究显示，槲皮素的抗氧化作用与其能够在体内和体外有效清除超氧阴离子、羟自由基(·OH)和单线态氧(1O2)等活性氧自由基、加强谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)活性有关〔8，9〕。体内和体外实验研究显示，槲皮素可通过抑制炎症细胞因子白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10、 IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、趋化因子CC配体(CCL)-8等的表达、通过不同信号转导途径如磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/核因子(NF)-κB和磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)/sirtuin(Sirt)1在急性痛风性关节炎、非酒精性脂肪性肝炎、血管炎和特应性皮炎等多种疾病中发挥抗炎作用〔10〕。此外，槲皮素被证实以剂量和时间依赖方式对肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、鼻咽癌、卵巢癌及乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖与侵袭具有显著抑制作用，并诱导肿瘤细胞的凋亡〔11〕。本研究通过构建慢性心力衰竭大鼠模型来研究槲皮素对心力衰竭大鼠心功能紊乱的改善作用机制。

1 材料与方法

1.1实验用大鼠、试剂和仪器 SD雄性大鼠(北京维通利华)；戊巴比妥钠(德国Sigma公司)；大鼠TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(中国博士德生物)；移液器(日本eppendorf 公司)；低温冷冻离心机(德国Sigma公司)；全自动定量酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；便携式彩色多普勒超声心动仪(荷兰Philips公司)；精密电子天平(日本AND公司)；离心管(美国corning公司)；高压灭菌器(日本三洋公司)；大鼠灌胃器(北京冀诺泰科技发展有限公司)；血管钳、止血钳、手术刀、手术剪、手术镊和缝合针(上海金粒医疗器械有限公司)；超低温冰箱(日本三洋公司)；-20℃冰箱(青岛海尔公司)；制冰机(广东中冷制冰科技有限公司)；大鼠手术台(上海玉研科学仪器有限公司)；小动物体重秤(美国双杰公司)。

1.2实验动物分组及模型制备 将购于北京维通利华的45只无特定病原体(SPF)级别的12周龄健康SD雄性大鼠(体重250～300 g)在空气流通、环境温度(23±2)℃、湿度适宜、相对安静、光照/暗循环12 h的环境下以常规饲料适应性喂养1 w；将实验动物随机平均分为对照组、模型组和槲皮素组；各组按45 mg/kg行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；常规手术区备皮和用75%酒精消毒后，用手术剪刀剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉和筋膜组织，剪开切口长度3～4 cm；用血管钳沿第三肋间钝性分离约3 cm长的肋间肌；打开胸腔及心包膜，并将结扎线在左心耳与肺动脉圆锥间穿过冠状动脉左前降支；模型组和槲皮素组进行结扎，而对照组不结扎；结扎30 min后剪开结扎线，逐层进行关胸缝合肌肉和皮肤。

1.3模型的鉴定和给药 手术4 w后，利用超声心动仪检测各组左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)，以LVEF<65%为模型制备成功；弃除不符合条件和死亡的大鼠后，槲皮素组连续每天灌胃给予槲皮素(100 mg/kg)，对照组和模型组则灌胃给予等量的生理盐水，灌胃持续时间为8 w。

1.4一般生命体征观察 每天按时观察各组实验大鼠的一般状态，包括精神状态、饮食、饮水状况、皮毛色泽、反应灵敏度及活跃程度等。

1.5心功能指标检测 在造模结束后4 w和治疗结束后两个时间点进行超声心动仪检测。检测前各组禁食不禁水12 h，然后行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，待用止血钳夹捏四肢不发生夹捏发射后，将大鼠固定于检测台上，用电推剪剃掉大鼠胸前毛发，将涂抹耦合剂的超声探头放置大鼠胸前，设定参数来检测各组LVEDD、LVESD和LVEF。

1.6血浆TNF-α水平检测 用ELISA检测各组TNF-α水平，具体操作如下：大鼠麻醉后抽取心室血；1 000 r/min离心15 min以收集血浆；向各孔中分别加入100 μl标准品和血浆样本；37℃孵育90 min；向各孔中分别加入100 μl TNF-α抗体工作液；37℃孵育60 min后用洗涤缓冲液洗涤3次；向各孔中分别加入100 μl ABC工作液；37℃孵育30 min后用洗涤缓冲液洗涤5次；向各孔中分别加入90 μl TMB显色液，37℃避光孵育15～20 min；向各孔中分别加入100 μl TMB终止液；酶标仪读取450 nm处OD值；绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.7统计分析 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1一般状况 灌胃给药8 w后，对照组精神状态良好、饮食、饮水正常、体重逐渐增加、皮毛光滑润泽、反应灵敏、活动频繁。模型组则精神状态差、神色萎靡不振、摄食量减少，体型消瘦，皮毛枯萎无光并出现脱毛、反应迟钝、倦怠懒动。槲皮素组上述一般状态和表现较对照组较差，但强于模型组。

2.2心功能指标 手术4 w后，未进行灌胃给药前，模型组和槲皮素组LVEF值显著低于对照组(P<0.01)，LVEDD和LVESD值则显著高于对照组(P<0.01)。模型组和槲皮素组LVEF、LVEDD和LVESD值无显著差异，这说明慢性心力衰竭可致大鼠发生明显的心功能紊乱。

灌胃8 w后，与对照组比较，模型组和槲皮素组LVEF值仍然显著降低(P<0.01)，而LVEDD和LVESD值仍然显著增高(P<0.01)。槲皮素组LVEF值显著高于模型组(P<0.05)，LVEDD和LVESD显著低于模型组(P<0.05)，这表明槲皮素对慢性心力衰竭大鼠的心功能紊乱具有一定的改善作用。见表1。

表1 各组心功能指标

2.3血浆TNF-α水平 用药后，与对照组〔(27.61±3.64)ng/ml〕比较，模型组和槲皮素组TNF-α水平〔(48.07±4.61)、(42.90±3.91)ng/ml〕显著增高(P<0.01)；与模型组比较，槲皮素组TNF-α水平显著降低(P<0.05)。

3 讨 论

槲皮素又称槲皮黄素或栎精，是从水果、蔬菜等天然植物中提取出来的多羟基黄酮类化合物，具有多种生物活性和广泛的药物学作用，在抗氧化应激、清除自由基、抑制炎性反应、参与免疫应答、抗肿瘤、调节器官功能等方面发挥重要的作用〔12〕。研究表明，槲皮素在心血管疾病中亦具有一定的保护作用，饮食中的槲皮素与冠心病的长期死亡率之间存在显著的负相关性〔13〕。此外，应用槲皮素可显著降低自发性高血压大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率，槲皮素还可增强内皮依赖性乙酰胆碱对离体主动脉的舒张作用，降低自发性高血压大鼠24 h前列腺素F2α 的尿排泄量和血浆丙二醛水平，表明槲皮素可减轻和缓解自发性高血压大鼠的血压升高、心脏和肾脏肥大及功能性血管变化〔13〕。心脏成纤维细胞在心肌重塑和心肌纤维化过程中起关键作用，而心肌重塑和心肌纤维化最终将导致心力衰竭。Wang等〔14〕研究证实，槲皮素二水合物可明显抑制成纤维细胞分化标志物Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达，降低由血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌纤维化、心脏收缩功能障碍、心肌炎症和心肌肥大，槲皮素二水合物对AngⅡ体外诱导的成纤维细胞增殖和分化亦具有抑制作用，提示槲皮素二水合物可能成为治疗心肌纤维化的潜在临床候选药物。槲皮素在治疗心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用，Liu等〔15〕研究表明槲皮素在体内和体外均可显著改善心肌的氧化损伤和细胞凋亡，抑制心肌缺血再灌注损伤诱导的NF-κB途径的激活。高胆固醇血症是肥厚型心肌病发展的危险因素，在对载脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的一项研究表明，敲除ApoE基因会使小鼠出现高胆固醇血症，与野生型小鼠比较，ApoE基因敲除小鼠的左室舒张末期后壁厚度和总左室质量明显增加，而当口服低剂量槲皮素后可在显著降低ApoE基因敲除小鼠血浆总胆固醇和极低密度脂蛋白的同时，还明显降低其左室舒张末期后壁厚度和左室重量〔16〕。另一项在ApoE基因敲除小鼠的研究中发现，使用槲皮素24 w后，可明显减少高脂饮食小鼠的动脉粥样硬化斑块面积，降低系统性氧化应激反应，阻断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活步骤，提示定期食用槲皮素对预防动脉粥样硬化具有重要的作用〔17〕。

与本研结果一致的一项有关高水溶性槲皮素对LVEF降低的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的疗效和安全性临床研究表明〔18〕，静脉注射槲皮素安全可靠，不仅不会产生任何严重的不良事件，而且还有助于改善ADHF患者的左心室收缩功能，降低心力衰竭的临床严重程度。TNF-α是评估慢性心力衰竭严重程度及疗效的常用指标，陈白玉等〔19〕报道慢性心力衰竭患者血清TNF-α含量显著升高，表现为心功能不全Ⅲ、Ⅳ级患者血清TNF-α含量明显高于心功能不全Ⅰ和Ⅱ级患者。作为一种炎症因子，TNF-α可使β-肾上腺素能受体分解，进而发挥负性肌力作用〔20〕。朱艳等〔20〕报道，TNF-α水平升高可使心肌和乳头肌的肌力显著降低，左室收缩能力随之减弱，进而导致心肌重构和心室泵血功能下降，TNF-α的表达可对恶性、衰竭性等重症心脏病症的发生和演进有明显的诱导作用。此外，TNF-α可经减少蛋白质合成、促进肌肉消耗等途径使心力衰竭患者活动耐量显著降低〔21〕。TNF-α还可诱导心肌细胞凋亡、诱使心室重塑，其表达上调可显著提高患者再入院和主要终点事件的发生率〔22〕。

综上，槲皮素对慢性心力衰竭大鼠心功能紊乱具有明显改善作用，其作用可能是通过下调TNF-α介导的抑制炎症反应来实现的。