LncRNA NNT-AS1通过靶向miR-496调控卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制

张欣萍 史天云 徐方方 徐全晓

(南阳市第一人民医院 1妇科，河南 南阳 473000；2肿瘤分子生物学医学重点实验室)

卵巢癌是一种危害女性生殖系统的恶性肿瘤，由于女性生殖系统及内分泌的复杂性导致卵巢癌患者术后复发率增加〔1〕。因而探讨卵巢癌发生及发展规律对改善患者预后具有重要意义。长链非编码RNA(LncRNA)是一种RNA聚合酶Ⅱ转录产物，研究显示LncRNA表达变化与肿瘤发生及发展关系密切〔2〕。卵巢癌组织中LncRNA异常表达可促进癌症发生及发展〔3〕。长链非编码RNA 烟酰胺核苷酸转氢酶-反义RNA1(LncRNA NNT-A S1)是一种新型LncRNA，研究发现LncRNA NNT-AS1在结肠癌细胞中呈高表达，下调LncRNA NNT-AS1表达后可抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭〔4〕。但LncRNA NNT-AS1在卵巢癌中的表达研究尚未见报道。LncRNA与微小核糖核酸(miRNA)可相互作用，并可通过调控一个或多个miRNA表达并参与蛋白质编码过程进而形成住转录因子调控网络〔5〕。通过生物学信息预测软件发现LncRNA NNT-AS1可靶向调节微小核糖核酸(miR)-496，miR-496在骨肉瘤细胞中呈低表达，上调miR-496表达可抑制骨肉瘤细胞增殖及迁移〔6〕。目前国内外对LncRNA NNT-AS1与miR-496在卵巢癌发生及发展过程中的生物学功能尚未阐明，因此本研究通过体外培养卵巢癌SKOV3细胞探讨LncRNA NNT-AS1与miR-496在卵巢癌下细胞增殖、迁移及侵袭中的作用及其可能机制，为靶向治疗卵巢癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 卵巢癌细胞株SKOV3与正常卵巢上皮细胞株IOSE-80均购自中科院上海生科院细胞库。miR-496 mimic、miR-496抑制物及其各自阴性对照均购自上海吉玛制药技术有限公司；胎牛血清(FBS)购自美国Invitrogen公司；LncRNA NNT-AS1 siRNA及其阴性对照均购自美国Dharmacon公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；Transwell小室购自北京明阳科华生物科技有限公司；Matrigel购自上海伟进生物科技有限公司；Lipofectamine2000转染试剂购自日本TaKaRa公司；MTT检测试剂盒购自上海东仁化学科技公司；逆转录试剂盒购自上海齐一生物科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自美国Sigma公司；荧光素酶活性检测试剂盒及荧光素酶报告在载体均购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 采用含有10%FBS的DMEM培养基培养SKOV3、IOSE-80细胞，置于恒温培养箱内培养(37℃、5%CO2)，2 d更换一次培养液，待细胞密度达到70%左右时采用胰酶消化细胞进行传代培养。收集对数生长期卵巢癌SKOV3细胞，接种于6孔板中，待细胞汇合度达30%左右时按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行转染。采用瞬时转染技术抑制LncRNA NNT-AS1表达即分别将LncRNA NNT-AS1 siRNA及其阴性对照转染至SKOV3细胞，分别为si-NNT-AS1组、si-NC组。构建LncRNA NNT-AS1过表达载体即分别将pcDNA与 pcDNA-NNT-AS1转染至SKOV3细胞，分别为pcDNA组、pcDNA-NNT-AS1组。将miR-496 mimic及其阴性对照转染至 SKOV3细胞，分别为miR-496组、miR-NC组。将anti-miR-496及其阴性对照分别与si-NNT-AS1共转染至SKOV3细胞，分别为si-NNT-AS1+anti-miR-NC组、si-NNT-AS1+anti-miR-496组。各组均于转染24 h后更换培养液。

1.2.2qRT-PCR检测细胞LncRNA NNT-AS1、miR-496表达 细胞培养72 h后收集对数生长期细胞，加入Trizol试剂提取总RNA，参照逆转录试剂盒进行反转录，配置qRT-PCR反应体系：2×STBR Green Taq PCR Mix 5 μl，cDNA样本1.6 μl，基因正反向引物各0.2 μl，ddH2O 3 μl。置于PCR仪反应，程序设置为95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，循环40次，72℃终延伸10 min。LncRNA NNT-AS1与miR-496均以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算LncRNA NNT-AS1与miR-496相对表达量。

1.2.3MTT检测细胞增殖 取各组对数生长期SKOV3细胞，利用培养液重悬细胞，调整密度为1.5×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔接种细胞体积为20 μl，分别于接种24 h后加入MTT溶液(40 μl/孔)，继续培养4 h后加入DMSO(200 μl/孔)，混匀后继续培养24 h、48 h、72 h，波长为490 nm时检测各孔细胞光密度(OD)值，OD值大小表示细胞增殖能力强弱，实验均设置3次重复。

1.2.4Transwell迁移实验 分别取各组对数生长期SKOV3细胞，采用不含FBS的培养液重悬细胞，调整细胞密度(1.5×105/ml)，以200 μl/孔的密度加入Transwell上室，含FBS的培养液加入Transwell下室(500 μl/孔)，置于培养箱继续培养24 h，采用甲醇固定Transwell上室，结晶紫染色后用棉签试去未穿过底膜细胞，显微镜下观察并随机选取5个视野计算迁移细胞个数，实验重复3次。

1.2.5Transwell侵袭实验 Transwell侵袭实验预处理：以1∶100稀释Matrigel基质胶与无FBS培养基，浸泡侵袭小室后再加入基质胶(100 μl)，采用紫外线消毒杀菌过夜，同时在上下侵袭小室分别加入200 μl、600 μl无FBS培养基。待细胞生长汇合度达到80%左右时收集各组细胞，重悬细胞后调整细胞密度为1.5×105/ml，Transwell下室加入含FBS培养基，上室加入重悬细胞，继续培养40 h，采用乙醇固定小室，结晶紫染色，擦去未侵入基质细胞，显微镜下随机选取5个视野观察计数，实验重复3次。

1.2.6双荧光素酶实验 分别将WT-NNT-AS1、MUT-NNT-AS1与miR-496 mimic共转染至SKOV3细胞，放入培养箱继续培养48 h，收集细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测各组细胞中双荧光素酶活性。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1LncRNA NNT-AS1和miR-496在卵巢癌SKOV3细胞和卵巢上皮细胞IOSE-80中的表达 采用qRT-PCR检测卵巢癌SKOV3细胞与卵巢上皮IOSE-80细胞中LncRNA NNT-AS1、miR-496表达水平，与IOSE-80细胞相比，SKOV3细胞中LncRNA NNT-AS1表达水平显著升高(P<0.05)，miR-496表达水平显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 NNT-AS1和miR-496在SKOV3细胞和IOSE-80细胞中的表达

2.2抑制LncRNA NNT-AS1表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响 si-NNT-AS1组SKOV3细胞中LncRNA NNT-AS1表达水平显著低于si-NC组(P<0.05)，提示转染成功。MTT检测结果显示si-NNT-AS1组SKOV3细胞OD值明显低于si-NC组(P<0.05)，见表2，表明LncRNA NNT-AS1沉默可抑制SKOV3细胞增殖。

表2 抑制 NNT-AS1表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

2.3抑制LncRNA NNT-AS1表达对卵巢癌SKOV3细胞迁移、侵袭的影响 si-NNT-AS1组迁移细胞数目与侵袭细胞数目均显著低于si-NC组(P<0.05)，见图1，表3。表明抑制LncRNA NNT-AS1表达可抑制SKOV3细胞迁移及侵袭。

图1 卵巢癌SKOV3细胞的迁移、侵袭(结晶紫染色，×200)

表3 抑制NNT-AS1表达对卵巢癌SKOV3细胞迁移、侵袭的影响

2.4LncRNA NNT-AS1靶向调控miR-496的表达 利用生物信息网站预测LncRNA NNT-AS1可能与miR-496有相似结合位点序列，见图2。双荧光素酶报告基因结果显示LncRNA NNT-AS1可抑制miR-496荧光素酶活性，见表4。采用qRT-PCR分别检测抑制LncRNA NNT-AS1表达及LncRNA NNT-AS1过表达转染后SKOV3细胞中miR-496表达变化，结果显示si-NNT-AS1组miR-496表达水平(1.03±0.08)显著高于si-NC组(0.39±0.04，P<0.05)，pcDNA-NNT-AS1组miR-496表达水平(0.17±0.03)显著低于pcDNA组(0.42±0.04，P<0.05)。表明LncRNA NNT-AS1可负向调控miR-496表达。

图2 NNT-AS1的3′UTR中含有与miR-1496互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.5miR-496过表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭的影响 分别将miR-496 mimic及阴性质粒转染至SKOV3细胞，qRT-PCR检测结果显示miR-496组miR-496表达水平显著高于miR-NC组(P<0.05)，细胞OD值、迁移细胞个数及侵袭细胞个数均显著降低(P<0.05)，见表5，表明miR-496过表达可抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭。

表5 miR-496过表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.6抑制miR-496表达逆转了抑制NNT-AS1表达对SKOV3细胞增殖、迁移侵袭的作用 为了证明 LncRNA NNT-AS1是通过调控miR-496表达对SKOV3细胞的生物学功能发挥作用，将si-NNT-AS1与anti-miR-NC共转染至SKOV3细胞，si-NNT-AS1与anti-miR-496共转染至SKOV3细胞，qRT-PCR检测显示si-NNT-AS1+anti-miR-496组SKOV3细胞中miR-496表达水平显著低于si-NNT-AS1+anti-miR-NC组(P<0.05)，si-NNT-AS1+anti-miR-496组细胞OD值、迁移细胞数目及侵袭细胞数目均显著高于si-NNT-AS1+anti-miR-NC组(P<0.05)，见表6。

表6 抑制miR-496表达逆转了抑制NNT-AS1表达对SKOV3细胞增殖、迁移侵袭的作用

3 讨 论

卵巢癌细胞迁移及侵袭是降低肿瘤治疗效果及导致患者死亡的主要原因，肿瘤细胞迁移、侵袭过程与多种生物分子及调控通路的相互调节作用密切相关，目前研究卵巢癌细胞迁移及侵袭主要集中在神经营养因子及黏附因子等方面〔7〕。近年来，研究发现LncRNA可参与细胞增殖、凋亡及迁移等生物学过程，LncRNA表达异常可促进或抑制肿瘤发生及发展〔8,9〕。LncRNA在卵巢癌中的作用成为研究热点，既往研究发现LncRNA H19与LncRNA FOXD2-AS1在卵巢癌组织或细胞中均呈高表达并可促进癌细胞增殖、迁移及侵袭〔10,11〕。关于LncRNA与miRNA在卵巢癌发生及发展过程中的具体作用研究较少，因此探讨LncRNA与miRNA的相互作用有助于卵巢癌诊断及治疗。

LncRNA NNT-AS1在胃癌细胞中呈高表达并可促进细胞增殖、抑制凋亡〔12〕。Li等〔13〕研究表明骨肉瘤细胞中LncRNA NNT-AS1表达水平升高并可通过抑制miR-320a表达进而促进骨肉瘤发生及发展。本研究结果提示LncRNA NNT-AS1可能在卵巢癌的发生过程中发挥癌基因作用。Wang等〔14〕研究发现LncRNA NNT-AS1可通过抑制miR-363表达进而促进胃癌细胞增殖及侵袭。沉默LncRNA NNT-AS1表达可抑制乳腺癌增殖及迁移等生物学过程，Li等〔15,16〕研究发现LncRNA NNT-AS1可增强肝细胞癌细胞增殖能力并抑制细胞凋亡，敲低LncRNA NNT-AS1可抑制细胞增殖并诱导下细胞周期阻滞。本研究结果说明LncRNA NNT-AS1可能主要通过增强SKOV3细胞增殖活性、迁移及侵袭能力进而参与卵巢癌发生及发展过程。应用starBase网站预测出LncRNA NNT-AS1可互补结合miR-496。LncRNA NNT-AS1可直接靶向调控miR-496表达。

miR-496在骨肉瘤组织及细胞中均呈低表达，miR-496过表达后可抑制骨肉瘤细胞迁移及侵袭〔17〕。相关研究表明miR-496表达降低还可促进乳腺癌发生及发展〔18〕。本研究结果提示miR-496可能在卵巢癌发生过程中发挥抑癌基因作用。周静怡等〔19〕研究表明结肠癌细胞中miR-496表达水平降低，miR-496过表达可能通过抑制Wnt /β-catenin 通路进而抑制结肠癌细胞增殖及迁移。Li等〔20〕研究报道指出抑制Wnt /β-catenin通路可抑制卵巢癌细胞迁移及侵袭。说明miR-496可能通过抑制SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭进而参与卵巢癌发生及发展。为验证LncRNA NNT-AS1靶向调控miR-496表达进而促进卵巢癌发生发展，本研究共同抑制LncRNA NNT-AS1、miR-496表达观察细胞活性、迁移及侵袭变化，结果说明抑制miR-496表达逆转了抑制NNT-AS1表达对SKOV3细胞增殖、迁移侵袭的作用。提示LncRNA NNT-AS1可通过降低miR-496表达继而促进SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭过程。