猪精液常温保存研究进展

白绪祥，韩帅琪，胡建宏

(1.陕西省林业科学院珍稀野生动物救护基地，陕西 周至 710402；2.西北农林科技大学 动物科技学院)

如今，人们对于优质肉奶蛋等畜产品的需求随着我国居民生活质量的不断提高在持续地增加，这一变化也推动了我国畜牧业的不断发展。在现代家畜的繁育过程中，我国养殖业的飞速发展离不开强大的技术手段的支持，而人工授精技术就是其中重要的一环。人工授精技术不但可以使优良基因得以迅速扩散，而且还可以减少相关畜禽类疾病的传播。在这一过程中，由于公猪的精液品质直接决定着母猪的受胎率，因此生产实践对种公猪精液提出了更高的要求。精液的保存也就成为了进行生猪人工授精时的关键性问题。

目前而言，精液保存分为常温保存、低温保存和冷冻保存三种方式，但是经过低温保存和冷冻保存的精子往往活力较低，容易使母猪繁殖成绩无法达到期望目标，从而影响到养殖场的经济效益。所以我国大多数生猪养殖场在进行人工授精时会选择以液态常温保存为主的精液，同时由于体外保存的精液质量会受到各种因素的影响，因此进行常温保存时稀释液的配方也成为关注的焦点。

1 猪人工授精技术的研究概况

在家畜繁衍的过程进程中，人类总是在尝试各种手段以期对其繁殖活动进行掌控，从而提高家畜的繁殖性能，满足人类需求。而人工授精技术便是其中使用最为普遍的手段。18世纪80年代，世界上首次人工授精试验完成，1932 年利用猪鲜精精液进行人工输精在实验室第一次取得了成功，直到上个世纪80年代，人工输精这项技术才真正的开始在生猪养殖业中进行发展和商业化应用。我国猪的人工授精业于上个世纪50年代起便开始在广西、江苏等地兴起。随着规模化，集约化饲养方式的逐渐兴起，人工授精技术也开始在我国普及开来，在过去10年里，公猪自动化采精系统、母猪深部输精和精液保存等系列技术的出现和广泛应用使得猪繁殖技术和生物安全性得到了极大的提生。而子宫颈后输精、子宫深部输精和腹腔镜输精技术等多种输精方式的出现及应用，也使猪人工授精的效率在一定程度上得到了提高。

人工授精技术是规模化猪场母猪繁殖的主要形式。就以往的方式而已，一头公猪每次交配仅仅只能使一头母猪怀孕，使优良种公猪资源得到了极大浪费。依靠人工检测发情，母猪能够每天在站立发情的状态下接受两次传统或低精子剂量的子宫颈或两次子宫内受精。每次输精使用的精液均为经过检验的优质精液。加之合适的输精时间，母猪受胎率得到了极大的提高。同时也使种公猪的配种效率和种用性能得到了充分的利用。

人工授精还能够克服杂交配种困难以及时间和地域的限制，使繁殖和育种工作不受时间以及空间的限制，使得优良遗传资源得到了充分的利用和广泛的传播。而精液的保存技术可以使精液长期保存下来，使得技术人员能够选择在任意时间和地点对家畜进行人工授精操作。冷冻保存的精液更是使精液的跨境以及国际贸易成为可能，优秀的遗传资源在这一过程中被传播开来。

2 猪精液常温保存技术研究进展

在生猪人工授精技术中的猪精液的保存是关键环节。按照精液存储时温度的差异可将其分为三种方法：一是常温保存通常在15～25 ℃下进行，二是在0～4 ℃进行的低温保存，三是将精液保存于-79 ℃(干冰)或-196 ℃(液态氮)的环境下称为超低温保存(冷冻保存)。在实际生产中，由于冷冻精液所需要的生产成本更高，并且精子活率远不如常温保存，容易降低母猪的受胎率和产仔数，所以对于我国规模化猪场而言绝大多数都选择使用液态常温下保存的精液进行人工授精，仅有少部分会使用冷冻精液。尽管精液常温保存存在着时间相对较短的问题，但具有精子活力高、精子受到损伤小、母畜受孕率高、设备要求低、人员操作简单等优点。

根据国家标准(GB 23238-2009)中关于猪精液常温保存的要求，精液在稀释保存3d后的精子活力不得低于60%，而精子畸形率更是不得高于10%。因此在种公猪精液常温保存过程中，常通过向稀释液中加入缓冲物质来为精子创造生存所需要的最适pH环境，添加一定的抗菌物质来延缓精液中微生物生长速度，以降低微生物的危害。同时加入适当的果糖，葡萄糖等糖类物质为精子提供营养物质，以期精液保存达到一个优秀的效果。刘琦等发现，氨基酸类保护剂(牛磺酸、L-谷氨酰胺)和中药活性成分(五味子乙素、三七皂苷R1)可以作为一种质膜保护剂，在精液常温保存的过程中具有保护精子质膜不受损害，增强精子的抗氧化能力，维持精子活率的作用。整体来说，精液的常温和低温保存技术已达到相对成熟的水平，但仍存在着精子的质膜完整率和顶体完整率难以保证，精子结构和功能不稳定等问题，这些问题的解决需要人们去进行更加深入的研究探讨。

3 猪精液常温保存稀释液成分

在生产实践中，优良的猪精液保存稀释液能够有效地提高母猪的受胎率与产仔率，使生猪养殖场的经济效益得到极大提升。以目前市场上存在的猪精液常温保存稀释液为准，其成分主要有单糖、多糖等营养物质、用以保持稀释液pH和渗透压稳定的无机盐和有机酸，降低微生物代谢与繁殖水平的抗菌物质以及抗氧化物质等。

3.1 稀释剂和营养剂

进行精液保存时稀释液的渗透压应与精液渗透压保持在同一水平，生产中常使用蔗糖、葡萄糖、氯化钠溶液等作为稀释液等渗物质。洪洁赟等研究发现，与生理盐水相比，含有葡萄糖的精液稀释液中的精子活率显著更高，这表明葡萄糖能够为精子提供维持精子正常代谢的能量。如果稀释液中缺乏葡萄糖则会使精子所需的能量无法满足，使精子的活率降低。在精子代谢过程中除了通过糖酵解产生的葡萄糖提供能量外，还存在着磷酸戊糖途径(PPP)和三羧酸循环。Qiu等的研究表明，公猪精子在17 ℃环境下储存时的代谢所需的能量可以由精液稀释液中提供葡萄糖和果糖的前体物质所满足。Bresciani等则通过对山羊精液储存过程中精子代谢时葡萄糖的代谢途径进行研究，发现相对于乳酸而言，葡萄糖和丙酮酸在保持山羊精子活力方面有着更好的效果。虽然糖酵解和PPP二者都不可或缺，但PPP比糖酵解对维持精子活力更为重要。PPP可以有效的减少氧化应激，并且能够为糖酵解反应提供更多的中间产物。在单羧酸盐转运蛋白的作用下，丙酮酸进入山羊精子，参与三羧酸循环和电子转移氧化，以维持精子的活力。

3.2 保护剂成分

3.2.1 缓冲物质 精液的pH环境可以影响精子的运动能力与代谢水平，在弱酸性环境中，精子的代谢和运动能力受阻，存活时间得以延长。然而在精液保存时，由于精子会产生酸性物质，导致pH过低，影响精子活率。因此，在进行精液常温保存时，通常会选择向稀释液中添加一定量的像弱碱性物质一类的缓冲物质来中和精子产生中的酸性代谢产物，避免因pH过低而使猪精液保存时间和保存效果降低。目前，市场上常被用来作缓冲剂的物质主要有磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠等，这类缓冲液可以有效地维持精液pH的稳定性。洪洁赟等研究报道，在稀释液中添加柠檬酸导致稀释液的pH相对较低，影响细胞膜渗透压，且添加碳酸氢钠能够起到缓冲作用。近些年来，实际生产过程中通常还会选择像三羟基甲级甲烷(Tris)及乙二胺四乙酸二钠(EDTA)这类的有机缓冲物质作为稀释剂中的缓冲物质。

3.2.2 抗菌物质 在精液在采集和保存的过程中，微生物的大量繁殖往往会降低精液品质，极大的缩短了精液保存时间。添加抗生素则可以让细菌污染得到有效的控制。在精液保存过程中，添加链霉素或青霉素可极大的延缓微生物的生长速度，从而达到提高精子的保存时间及精子活性的目的。张金龙等通过对比多种不同抗生素对猪精液稀释液的效果，发现对精液保存的效果最好的是磺胺类抗生素，在18 ℃的环境条件下精子的有效保存时间可达4.38 d，精子的存活指数为3.14。然而抗生素的过多使用也导致了细菌对过去常用的抗菌剂诸如青霉素、链霉素等已经产生了很强的耐药性，所以很多科学家积极致力于开发抗生素的替代物。为了保护公猪精液，越来越多的研究人员将目光聚焦于基于抗菌肽(AMP)的常规抗生素替代品。Schulze等研究表明，阳离子抗菌肽能够作为一种新型的抗菌添加剂用于猪精液稀释液中，添加后可以对公猪精液保存产生一个良好的效果。在16 ℃的环境温度下，合成的环六肽(c-WFW)和合成的螺旋藻皂苷II酰胺衍生物可以使公猪精子保存4天。

3.2.3 抗氧化物质 精子在进行呼吸代谢时会产生ROS。处于低浓度的ROS环境下精子的活力和受精能力均会得到增强；然而当浓度超过一定范围时，ROS会作用于精子质膜，使精子质膜上磷脂产生过氧化反应，从而破坏精子的质膜结构，使精子的功能无法发挥；ROS 还可以通过破坏精子细胞核中的DNA 结构的方式引起精子凋亡；此外，ROS 可降低精子质膜和胞内酶的活性或者造成酶失活，使ROS 大量聚集在精子细胞内导致一种恶性循环，使精子氧化损伤加深而死亡。

研究发现谷胱甘肽及其还原性前体可以有效地缓解蛋白质分子和酶分子的氧化压力以及抵抗细胞凋亡，使精子的活力和受精能力得到有效的提升。褪黑激素则具有较强的抗氧化作用，并且能使谷胱甘肽氧化酶的活性得到极大的增强，从而实现延缓精子衰老的目标。另外VE也可以通过抑制自由基的形成，防止精子质膜上发生氧化反应以及破坏活性氧在脂肪酸侧链和质膜中形成的共价键来起到抵抗活性氧的作用。

3.2.4 其他添加剂 在精液常温保存稀释液中也可以添加一些酶类、维生素或激素类物质等。例如可以通过添加过氧化氢酶来分解精子代谢过程中所产生的过氧化氢，在一定程度上达到延长精子存活时间的目的。像二氧化碳、乙酸等其他添加剂成分则可以降低精液的pH，抑制精子的运动能力，减少精子本身的能量消耗。而还有一些物质作为添加剂可以对母畜造成一定影响，例如催产素、前列腺素等激素类物质可以通过促进母畜生殖道的蠕动，来提高母畜受胎率，以此提高经济效益。